第9章_转基因表达.ppt

第9章 转基因沉默机制 一、植物转基因的一些问题 1. 转基因的沉默, 技术和科学问题，涉及到转基因的应用。 2．转基因植物对生态环境的影响和转基因食品的安全性等问题。 外源基因与受体基因组整合，但该基因不表达或表达水平降低，或者植物新获得的遗传特性随着植物自身的繁殖在后代中又消失，这种现象转基因沉默（transgene silencing）或转基因失活（transgene inactivation）。 对于育种来说，这无疑是不受欢迎的实质性障碍。 对于基因表达来说，转基因植株为研究目的基因的表达调控提供了优良的材料。通过深入研究可加深理解自然植物在DNA水平上调控基因的表达，或在细胞质中通过mRNA水平来调控基因的表达。 二、转基因沉默的可能机制 转基因沉默并不是所转化的基因发生了丢失或突变，而是整合进植物基因组的外源基因在转化体的当代或其后代中出现了基因失活或表达受到抑制的现象。 转基因的拷贝数和构型 转基因在基因组中的整合位点 转基因的转录水平和翻译水平 环境因子对转基因表达的作用 转基因沉默主要分为两类， 转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），发生在核内 转录后水平的基因沉默（Posttranscriptional gene silencing，PTGS） 发生在细胞质中 都是核酸的相互作用，即DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA。 1．DNA的拷贝数和其结构 转基因沉默与转基因的拷贝数和其构型有关。 DNA-DNA相互作用。 多拷贝的整合方式并未使基因表达水平有所增加，反而使DNA发生甲基化或其他原因引起基因失活。农杆菌介导的转化方法比DNA 直接转化法所产生的拷贝数低。外源基因的拷贝数低也并一定能导致基因的充分表达，所以转基因拷贝数的多少对基因表达没有定论。倾向于多拷贝导致基因沉默。 诱导重复DNA甲基化（repeat—induced DNA methylation），转基因作为串联重复或反向串联重复插入基因组同一位点则倾向于失活，因重复会导致甲基化，通常，在一个位点内拷贝数愈高，失活愈严重。 外源基因的构型是指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组中。 （1） 顺式失活（cis-inactivation），指紧密连锁的多拷贝的转基因以正向或反向相互串联而使基因失活。这种构型在DNA直接导入中常见，多以甲基化的方式发生。 （2）反式失活（trans-inactivation），指转基因以顺式方式插入并发生失活，作为一个沉默子（silencer）而引起不同DNA分子上同源的等位或非等位的目标基因失活 2．位置效应 外源基因整合到染色体的物理位置就直接决定着外源基因的表达，这种情况称为位置效应（position effect）有两种情况，（1）外源基因插入染色体中高度甲基化的区域或异染色质区，外源基因的甲基化而导致基因沉默。 （2）外源基因的碱基组成与整合区域的不同而被受体细胞的防御系统所识别，不进行转录使基因沉默。 3．DNA甲基化 DNA甲基化是植物发育分化过程中调控基因表达的手段之一，DNA甲基化也是植物细胞最常用的防御外来遗传物质入侵的现象，它可以识别与植物基因组DNA序列组成不同的外源基因并对其甲基化，引起基因沉默。 DNA 甲基化主要发生在基因的5‘端的启动子区域，阻碍转录因子与启动子的结合，从而引起转录抑制。DNA甲基化引起的外源基因沉默可以被逆转，利用去甲基化试剂可以恢复外源基因的表达。 转录后水平的基因沉默 这类沉默是RNA-RNA的关系，基因的启动子（promoter）是活跃的，基因能转录，但不能积累。因转基因和内源基因有很大程度的同源性而抑制了内源基因的表达，这一现象在植物中称共抑制（cosuppression）。 1． RNA与阈值 转基因产生大量的RNA而超过一个正常的标准或阈值（threshold），将激活RNA依赖性的RNA聚会酶以此转录物为模板合成配对的RNA，结果促使同源RNA（不管其来源）的去除，而造成RNA不能积累。这一现象通过对病毒抗性得到支持，如转基因植株高表达转基因mRNA但不能积累，但对同源RNA病毒的抗性提高，反之具较低水平转录，对RNA 病毒侵染却是敏感的。 2．甲基化 PTG S情况下的甲基化，启动子仍活跃和正常转录。常见转基因编码区的上、下游都被甲基化，转录产物通常缩短了，即甲基化的部分转录受阻。 RNA指导的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation），在转基因烟草中发现有3-4个顺序排列的viroid cDNA被甲基化，这种甲基化不是转基因的重复所产生，而是 viroi