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⑵烯唑醇 7、代森类 8、有机氯类 ⑴稻瘟酞 ⑵地茂散 Thank you! 分子克隆的基本操作技术 体外 剪切、拼接、重组 转化 基因重组体 （recombinant DNA） 基因产物 目的基因的获得 PCR技术 酶切，连接策略 转化技术，目的重组子的筛选 高效表达方法 聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction,PCR): 一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,又称为基因的体外扩增法。 1985年 美国Cetus公司 Mullis等人开发 1993年 Mullis 诺贝尔化学奖 目的基因的获得和序列分析 PCR 的反应体系 模板DNA（template） 引物（primer）:与被分离的目的基因的DNA双链两 端序列相互补的DNA，约20个碱基左右； TaqDNA 聚合酶／pfu高保真聚合酶； dNTP 缓冲液（buffer） （PCR增强剂） 一般PCR反应可扩增出100—5000bp的目的基因 PCR基本反应过程 1，变性 95℃，双链解开成单链 2，退火 55℃左右，引物配对 3，延伸 72℃，合成新链 30个循环左右 PCR 的目的? 引物的设计 1、引物长度（primer length） 常用的是18-24 bp，不要大于38bp，因为过长会导 致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进 行反应。 2. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。 若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引 物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 3. 引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末 位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发 效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 4. 碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高 的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模 板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不 要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或 C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物长度，它对扩增特异性影响不大。 因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。 引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物的延伸是从3′ 端开始的，不能进行任何修饰。 给酶切位点添加保护碱基 限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。保护碱基常见于PCR引物设计时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，使酶切完全而添加。 其次，在分子克隆时，选择载体的酶切位点也会碰到，相临的2个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 6. 引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构 （Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止 引物二聚体（Dimer与Cross dimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 7. 引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步实验了。 各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 至于设计软件，PRI