海洋生物技术—海洋动物细胞培养定稿.pptVIP

第二章 海洋动物细胞培养 一、 细胞工程与动物细胞培养 二、 海洋动物细胞培养（以鱼类细胞培养为 例，海洋无脊椎动物细胞培养自学 三、鱼类细胞培养的应用 3 动物细胞工程 动植物、微生物细胞的培养特征 2. 鱼类细胞培养的方法与技术 2.1鱼类细胞培养基的选择 主要是合成培养基，常用的有以下几种：Eagle?s MEM、Leibowitz L-15、M199和M1640。Eagle?s MEM适用于多种细胞的生长培养，如CCO、AS、CHSE-214、RTG-2等，还可以通过在其中添加或减少某些成分用于特殊研究的细胞培养，是一些海水鱼类细胞系培养常用的培养基；M199所含的营养成分丰富而且全面，可以在细胞培养中用作维持液，可以使一些细胞的存活时间达到33天，是一些淡水鱼类细胞系常用的培养基； 在对鱼类组织进行细胞培养时，要根据不同种类的鱼选择适合其生长的培养基。在培养海水鱼类细胞时，要在培养基中加入适当量的NaCl（1.5%），以维持渗透压（4ⅹ105Pa），但是NaCl的浓度不能太高，太高会不利于细胞生长。 M199培养基：本培养基最初专用于鸡成纤维细胞的的营养研究。如今，M199培养基广泛用于非转化细胞、疫苗和病毒的研究以及上皮细胞的原代培养。 从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养，均可采用分批式、分批补料式、半连续式、连续式等多种培养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。 酶消化法：该方法是目前细胞培养中最常用的方法，适用于绝大多数组织器官。所用的酶主要是胰酶，常用浓度是0.25％。根据酶消化时温度的不同，又可进一步分为冷消化法及热消化法。冷消化法是将组织剪成约2mm3的小块，然后置于5～20倍体积的胰酶中，4℃越夜(16～18h)，这种方法可以获得较高的细胞产量和成活率；热消化法作用的温度通常是15～20℃，作用时间30～60min。消化完成后，弃胰酶，加入培养基吹打，最后分瓶，放入 CO2培养箱培养。 利用体外培养的鱼类细胞代替活鱼进行毒理实验； 优点： (1)细胞的均一性好，在遗传上极为相似； (2)药物与细胞直接作用，反应速度快； (3)可结合多种技术方法测知药物效应； (4)比用活鱼更经济、方便。 Raehlin和Perlmuaer于1968年首次将体外培养的鱼类细胞用于检测环境污染物对水生生物的毒性作用。在此后的几十年间，利用体外培养鱼类细胞对环境毒物， 包括基因毒物、诱变剂、致癌物、环境激素和内分泌干扰素，进行污染监测和安全性评价，成为鱼类细胞培养的重要用途之一。 有资料表明：氯化铵可以抑制传染性胰坏死病毒在CHSE-214细胞中增殖， 苯丙咪唑钠可抑制传染性造血器官坏死病毒在FHM细胞的增殖。 3. 鱼类肿瘤 水环境中基因毒物的不断增加及其对鱼类的基因毒性生态学效应越来越受到广泛关注。GESAMP在1991年证明水中的基因毒物与鱼类肿瘤发生密切相关。因此，培养鱼类的癌细胞是研究肿瘤发生机理的途径之一。美人鱼神经纤维瘤(DNF)是一种自发性鱼类肿瘤，Schmale等1996年从培养的DNF细胞系中分离出一种反转录病毒，认为该病毒是DNF形成的诱因。近年，郭华荣等在牙鲆鳃细胞系FG培养中发现肿瘤性转化，这在鱼类细胞系中是首次报道，他们从形态学、非贴壁依赖性和遗传变异方面分析了FG发生肿瘤转化的特点，这对于了解鱼类细胞系的转化和肿瘤发生有重要意义。 4. 活性物质 海洋动物的细胞还可能用来生产昂贵的药物。已经发现，不少海洋动物能合成抗癌、抗病毒、抗心血管病的药物。例如，已经从柳珊瑚、软珊瑚、苔藓虫、海兔、海鞘中发现抗癌物质 在柳珊瑚和海绵中发现广谱抗菌素。若能查明这些动物的哪类细胞能合成药物．便有可能用细胞培养法来生产。 资料表明，鲨鱼终生不会生癌，这是因为在鲨鱼体内有一种名为硫酸软骨素的活性物质。但目前还没有鲨鱼细胞系建立的报道。如果建立鲨鱼软骨细胞系，将使硫酸软骨素的大规模生产方便而低成本。 5.资源保护 鱼类细胞系还能够应用于资源保护领域。对珍贵的野生动物和有重要经济价值的动物，人们已从不同水平对这些物种保护进行了研究，我国已经建立了野生动物细胞库，鱼类细胞库是建立在细胞培养基础上的。由于鱼类干细胞具有该种的全套基因且具有发育潜能性，保存住了细胞就意味着保存了该物种基因，这对鱼类种质资源保护有重要意义。张义兵等于2000年报道了白暨豚组织培养的初步研究。建立白暨豚的永久细胞系，对研究白暨豚的细胞遗传学、细胞生物学以至资源保护都有重要意义。 3、半连续式培养(Semi-continuous culture) 半连续