生物大分子分离纯化及肝酶提取.pptVIP

2.制作组织浆液 取新鲜动物肝脏剪碎冰放进培养皿中 移入匀浆器 过滤 梯度离心获得含有酶的细胞液 1：离心管中加入5ml 0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻轻覆在 其上，1600r/min离心10min，得上清液（1） 2：沉淀加10ml 0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心10min， 得上清液（2） 3： 将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min离心 10min，得上清液，即为酶体和微粒体 3.肝酶的粗提 原??? 理 ??? 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面电荷和水化膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白质所需盐类的浓度不同。例如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。）因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。 实验步骤 配制高浓度的硫酸铵溶液，测溶液PH值并用稀 硫酸或氨水调PH到6.2 将酶溶液与硫酸铵溶液混合，静止一段时间 离心，去上清，留沉淀 加蒸馏水溶解，将溶液放入透析袋中透析，得含酶 的溶液 离子交换柱层析法实验原理 混合物在经过固定相和流动相的过程中，不断地 进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，由于其中各 组分间在理化性质上存在着差异，因此当它们经过上 述相同重复过程时，各自的情况就有会所不同，从而 使各物质得以分离。 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素； CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素； DEAE—纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子 交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质 被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度 办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 实验步骤 DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl） 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或磺基水 杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号为横坐标，收 集第二个峰的蛋白溶液 处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含量为纵坐 标，收集管号为横坐标，收集第一个峰的酶溶液 即为PI=6.2左右的蛋白质溶液 5.活性检验 实验原理 结合酶的辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度 不同分为辅基和辅酶，辅基与酶蛋白共价键紧密结合， 透析超滤等物理方法不能除掉，辅酶与酶蛋白非共价 结合，较为疏松，透析和超滤等方法可以分离。 实验步骤 若结合酶含有辅基，则直接加入底物，根据生成物的 性质进行生成物的鉴定 若结合酶含有辅酶，则加入辅助因子（小分子有机化 合物和金属离子）然后再加入底物鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶的分离纯度 6.鉴定肝酶纯度 实验原理：Acr (丙烯酰胺) + Bis (交联剂N) 网状结构凝胶 引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED） SDS(十二烷基磺酸钠:阴离子表面活性剂）能打断蛋白质的氢键和疏水 键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷 的量远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差 异。 SDS常用来检测蛋白质样品的纯化程度，如果被 鉴定的蛋白质很纯，只含有一种三级结构的蛋白质或含 有相同分子量亚基的具有四级结构的蛋白质，那么SDSPAGE后就只出现一条蛋白质区带。 不连续凝胶电泳的支持体由分离胶和浓缩胶组成。上 层为浓缩胶，下层为分离胶，两层中Acr（丙烯酰胺） 浓度不同，孔径大小就不同，带电荷蛋白质离子在浓缩 胶中泳动时，因受阻力小，泳动速度较快。当泳动到小 孔径分离胶时，遇到阻力大，移动速度逐渐减慢，使样 品浓缩成很窄的区带。 分离胶的孔径有一定大小，对不同相对分子质量的蛋 白质来说，通过时受到的阻滞不同，即使静电荷相等的 颗粒也会由于此分子筛的作用，将不同大小的蛋白质分 开。 实验步骤 待测蛋白质样品的制备（加入4*缓冲液） 垂直板状聚丙烯酰胺凝胶的灌制 加样（酶溶液） 电泳（浓缩胶80V 分离胶150V） 剥胶 染色和褪色（0.25%考马斯亮蓝R250 漂洗 脱色） 得出一条带则说明分离的蛋白质纯度较高 匀浆液+药品混匀 转移 离心 粗蛋白 * 4.肝酶的纯化 层析： 离子交换层析：定相是具有固定电荷的离子交换剂，动相是具有不同PH值和离子强度的溶液 凝胶层析：又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层析等。主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效应不同而进行分离的。 吸附层析：主要根据物质对活性固体表面吸附亲和力的差异来分离。 分配层析：是根据素质在定相中溶解度的差异或在定相和动相中溶解度的差异来进行分离的 亲和层析：是根据生物大分子的生物特异性吸附来进行