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蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册 蛋白免疫印迹杂交（Western BlotWB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。 本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备 1 细胞或组织裂解 2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量 4 电泳上样样品的准备 B 电泳 1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳 C 转膜与显色（Western Blot） 1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜 3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色 D 常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS胶的配制 WB概述:检测原理 A 蛋白样本提取制备 蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项： 1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 （通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品） 2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择） 3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略） 5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 A-1 细胞或组织裂解 A-1-1 细胞裂解 裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择* 目的蛋白分布定位 推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒 全细胞 NP-40 or RIPA（附录1） 全蛋白抽提试剂盒 细胞质（可溶蛋白） Tris-HCl（附录1） 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒 线粒体蛋白提取试剂盒 细胞质（细胞骨架等不溶蛋白） Tris-Triton（附录1） 蛋白分级抽提试剂盒 细胞质（磷酸化蛋白） 磷酸化蛋白抽提试剂盒 细胞膜 NP-40 or RIPA（附录1） 膜蛋白抽提试剂盒 蛋白分级抽提试剂盒 细胞核 RIPA（附录1） 核蛋白抽提试剂盒 线粒体 RIPA（附录1） 线粒体蛋白抽提试剂盒 亚细胞定位蛋白抽提试剂盒 细胞裂解操作方法： 1. 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2） 2. 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask 3. 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4. 4℃摇动30 min 5. 4℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力） 6. 弃沉淀，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本 A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml) 4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀 A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制： 备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下： ?? 所有步聚均需在通风橱中进行： 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发 4. 冷却至室温 5. 再调pH至9.0 6. 再煮沸至无色 7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积 9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用 A-3 蛋白定量 Bradford法 Lowry法或BCA法 （均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂，则推荐使用BCA 法。三种方法或产品比较列表如下： 方法 原理 灵敏性