P38抑制剂体外对细粒棘球蚴原头节的作用.pdfVIP

目 录 摘 要I Abstract II 英文缩略语表 Ⅳ 前 言 1 材 料 3 1.细粒棘球蚴原头节的收集 3 2.主要试剂 3 3.主要仪器设备 3 4.主要试剂配制4 方 法7 1.细粒棘球蚴原头节的分离及体外培养7 2.P38 抑制剂ML3403 体外作用于细粒棘球蚴原头节7 3.倒置显微镜观察ML3403 体外对细粒棘球蚴原头节形态和活力的影响7 4.扫描电子显微镜观察ML3403 作用后原头节表面结构的变化7 5.透射电子显微镜观察ML3403 作用后原头节内部结构的变化7 6.Western blot 检测ML3403 作用后原头节内p38 蛋白表达水平 8 7.Caspase-3 活性检测试剂盒检测ML3403 作用后原头节体内caspase-3 酶活性 10 8.统计学方法 11 结 果 12 1.光学倒置显微镜下观察ML3403 对细粒棘球蚴原头节形态的影响 12 2.ML3403 对细粒棘球蚴原头节生长的影响 15 3.ML3403 对细粒棘球蚴原头节超微结构的影响 16 4.ML3403 对细粒棘球蚴原头节内p38 蛋白表达水平的影响 19 5.ML3403 对细粒棘球蚴原头节内caspase-3 酶活性的影响22 讨 论23 结 论26 参考文献27 文献综述 30 致 谢 37 作者简历 38 导师评阅表 39 摘 要 目的：本研究以体外培养的细粒棘球蚴原头节为研究对象，将不同浓度的P38 抑制剂ML3403 体外 作用于细粒棘球蚴原头节，探讨P38 抑制剂ML3403 体外对细粒棘球蚴原头节的作用。 方法：从自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏内采集细粒棘球蚴原头节，将其加入RPMI 1640 培养基 中体外培养，5d 后，将原头节分别加入不同浓度ML3403 （12.5、25、50、80、100μmol/L）中体外 孵育。每组加入原头节约2000 个。不同浓度ML3403 作用不同时间，在光镜下观察原头节的形态变 化，同时利用伊红染色的方法显示原头节的活力并绘制活力曲线；电子显微镜下观察原头节超微结 构改变；用Western blot 检测原头节内p38 蛋白表达水平；用Caspase-3 活性检测试剂盒检测原头节 内caspase-3 酶活性。 结果：孵育 5d 后，正常和 DMSO 对照组的原头节形态和活力几乎没有改变，而 50μmol/LML3403 组原头节活力下降约50.5% 。通过伊红染色观察发现，随着ML3403 作用时间的延长和浓度的增加， ML3403 对原头节的生长抑制作用越明显。连续观察5d，100μmol/LML3403 组对原头节有较强的杀 伤作用，此时几乎没有存活的原头节；80μmol/L 和 50μmol/LML3403 组的头节活力也分别仅为 13.34±2.09%和49.5±1.88% 。扫描电镜下观察发现ML3403 作用初期，原头节体表出现指状突起、顶 端体表出现皱缩，随着作用时间和浓度的增加，渐出现顶突界面缺损，吸盘变形，虫体表面出现凹 陷，指状突起增多，甚至出现虫蚀样损害。透射电子显微镜下观察发现原头节体被合胞体带变薄， 结构松散，囊泡扩张，微毛减少，甚至消失；部分实质细胞基质浓缩，细胞核核周隙增宽，核仁消 失，核异染色质凝集，边缘化。Western bolt 检测显示，ML3403 可降低细粒棘球蚴原头节内p38 蛋 白表达水平。Caspase-3 活性检测发现，较正常对照组，ML3403 可使原头节的caspase-3 酶活性增加。 结论：P38 抑制剂 ML3403 在体外有明显的抗细粒棘球蚴原头节的作用，有望成为一种新型的抗包 虫药物。 关键词：P38 抑制剂；细粒棘球蚴原头节；体外实验 论文类型：A(基础研究) I