十章 园艺植物遗传转化1ppt课件.pptVIP

第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 （七）使用基质结合区序列 基质结合区（MAR）又称核骨架结合序列（SAR），是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异性结合的DNA序列，大小为300～2000bp，富含AT和保守结构区域。 研究发现，MAR是一种新的顺式作用元件，将其置于所转基因的两侧，构建成MAR-gene-MAR，可以创造一个独立的结构域。这样可克服基因组对外来基因的识别和抑制，并阻隔了周围染色质顺式调控元件的影响，减少位置效应，显著提高转基因的表达水平。 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 （八）防止甲基化 DNA甲基化现象广泛存在与动植物细胞中，它影响DNA的许多重要的生物学功能，包括DNA复制起始、突变、限制修饰系统、基因表达调控及组织分化等。 研究表明，在高等植物DNA中约30%的胞嘧啶核苷酸被甲基化，DNA甲基化具有抑制基因表达的作用，活化的基因往往处于未甲基化状态，通过改变DNA甲基化状态可以调控基因的表达。 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 （九）改造外源基因 基因结构组成5′端序列、poly（A）信号和内含子等对转化外源基因的表达具有调控作用。研究发现，真核生物mRNA起始密码子前约100bp的非转译序列是其正常转译所必须的，且这段RNA的碱基组成对转译活性有重要影响。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 一、基因沉默技术 （一）病毒介导的基因沉默技术 定义：病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种通过抑制基因转录水平研究植物基因功能的方法。VIGS技术技术应用最成功的植物是本生烟草。烟草脆裂病病毒（TRV）已经被用于在烟草中进行大规模高通量的基因功能研究。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 VIGS技术的具体内容： 1.原理： VIGS是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到植株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将內源的目的基因mRNA降解，从而达到基因沉默的目的，属于一种转录后基因沉默现象。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 2.基本操作步骤 VIGS技术的基本操作步骤： 1）克隆靶基因； 2）构建含靶基因核心序列的病毒遗传载体； 3）将病毒载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌，以真空渗透或注射渗透的方式感染幼嫩植株； 4）筛选目的表型突变体。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 3.优缺点 VIGS技术的优点： 1）仅用一个蜘蛛就能鉴定一个表型； 2）结果可被迅速放大和重复； 3）产生目的表型的基因序列可迅速通过检测VIGS载体来鉴定； 4）是一个转染过程，不需要遗传转化过程，所需时间短； 5）在植株幼苗期感染，可获得发育相关基因沉默的表型突变体； 6）可克服基因家族功能冗余的缺点； 7）可迅速比较不同物种之间的基因功能 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 VIGS技术的局限性： 1）很难得到完全抑制靶基因表达的结果，降低的转录水平仍然可以产生足够的功能蛋白，很可能遗漏沉默表型不明显的植株； 2）沉默水平因不同的植株和不同的实验有所差异； 3）沉默效率依赖病原体与宿主之间的关系，病毒感染植株可能会改变植株的发育尤其是株高以及叶片形态； 4）沉默的微弱表型被病毒自身引起的表型所掩盖会遗漏一些目的植株。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 （二）RNAi技术 定义：RNA干扰（RNAi），是一种双链RNA（dsRNA）分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或其沉默的技术，属序列特异性的转录后基因沉默。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 1.基本操作步骤： 1）用特异引物RT-PCR法克服靶基因cDNA； 2）以cDNA为模板合成dsRNA； 3）构建含靶基因RNAi片段的干涉载体，克隆进大肠杆菌和农杆菌； 4）农杆菌介导转化并筛选、鉴定获得转化植株； 5）对转化植株进行表型评价，确定靶基因的功能。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 2.优缺点 RNAi技术的显著优点： 1）对目的基因序列特异性和高效干扰： 2）转化植物以孟德尔式遗传； 3）可在特定的发育阶段进行基因沉默； RNAi技术的局限性： 需要繁重的遗传转化过程，耗费时间较长，可能会因为插入基因的多拷贝性或者插入位点的不同引起缺失表型的复杂性。 第五节 基因沉默技术与基因剔除技术 二、基因剔除技术 定义： 基因剔除，又称基因打靶技术，是利用同源重组、点突变或随机突变、RNAi等途径是机体已知结构的特定基因失活或缺失的技术，是一种新型分子生物学技术。 第五节