国家精品课程基因工程课件chapter7.pdf

第七章DAN序列分析 • Sanger等(1977)提出的酶法及Maxam和Gilbert (1977)提出的化学降解法。其原理大相径庭，但这 两种方法都是同样生成互相独立的若干组带放射性 标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点， 但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。由于 DNA 上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均 等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合 物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原 DNA全片段上的位置所决定。然后在可以区分长 度仅差一个核苷酸的不同DNA 分子的条件下，对 各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸 加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道这上，即可从 凝胶的放射自影片上直接读出DNA 上的核苷酸顺 序。 2009-11-26 2 一、Sanger双脱氧链终止法原理 • 现行的链终止法由加减法序列测定技术发展而 来的。加减法首次引入了使用特异引物在 DNA 聚合酶作用下进行延伸反应、碱基特异 性的链终止，以及采用聚丙烯酰胺凝胶区分长 度差一个核苷酸的单链DAN 等3种方法。尽管 有了这些进展，但加减法仍然太不精确，也太 不得法，因此难以广为接受。直至引入双氧核 苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，酶法DNA序 列测定技术才得到广泛应用。 2009-11-26 3 • 2‘,3ddNTP 与普通dNTP不同之处在同它们在脱氧 核糖的3 位置缺少一个羟基。它们可以在DNA 聚 合酶作用下通过其5 三磷酸基团掺入到正在增长 的DNA链中，但由于没有3羟基，它们不能同后 续的dNTP形成磷酸二酯链，因此，正在增长的 DNA链不可能继续延伸。这样，在DNA合成反应 混合物的4种普通dNTP 中加入少量的一种ddNTP 后，链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止 展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长 度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现 过早链终止的位置之间的距离。 –谁终止，碱基就是谁! 2009-11-26 4 在4 组独立的酶 反应中分别采 用4种不同的 ddNTP ，结果 将产生4 组寡核 苷酸，它们将 分别终止于模 板链的每一个 A 、每一个G 或 每一个T 的位置 上。 2009-11-26 5 快 得 跑 谁 看 ， 泳 电 荧光