基因克隆与克隆基因的表达.ppt

荧光蛋白基因克隆猫 科学家复活冰冻死老鼠 修正基因蚊子防控疾病 基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛 基因克隆胚芽造就健康婴儿 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 强启动子 终止子 SD序列 1、原核表达质粒的元件： ori PT7 SD MCS Terminator Prokaryotic Expression Plasmid Prokaryotic promoter Lac I start piont Ampicillin resistance 克隆元件： 表达元件： 复制原点插入位点 筛选标记 启动子 终止子 SD mRNA 多肽链 利用强启动子，增加蛋白质的生物合成 转录起始的速率是基因表达的主要限速步骤， 因此，选择强的、可调控启动子是组建一个高效表达载体首先要考虑的问题。 原核表达载体的启动子都是可诱导的, 目的是在需要目的蛋白的时候才表达它. 最理想的可调控启动子应该是： 早期阶段：启动子被阻遏 当细胞数目达到一定密度时：通过诱导使阻遏物失活，RNA聚合酶快速起始转录。 Plac： 受Lac阻遏蛋白负调节， 受IPTG的诱导。 PL启动子：噬菌体早期 左向启动子。 常用的 原核启动子 PR启动子：噬菌体早期 右向启动子。 受λ噬菌体CI基因调控 乳糖操纵子结构：调控元件 + 结构基因 RNA Pol. 阻遏蛋白以恒定的速度表达，特异性地结合到操作子上， 对操作子的调控： 乳糖或类似物是阻遏蛋白的诱导物。 O H OH H H H OH H OH CH2OH O H OH H H H H OH CH2OH O OH IPTG is an analog of lactose but can not be hydrolyzed by galactosidase. Lactose Why IPTG? (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, 异丙基硫代半乳糖苷) 乳糖操纵子的应用： 利用乳糖操纵子的基本原理构建原核细胞表达载体。 IPTG:类乳糖诱导剂 “O”持续开放 培养基葡萄糖耗尽 “P”开放 pET vectors and BL(DE3) inducible system (Novagen) 终止子： 强终止子、二聚体终止子 转录过度的危害： 影响目的基因的转录和翻译效率 干扰基因载体的复制等生物学功能 增加受体细胞的无效能量消耗 启动子 终止子 SD mRNA NNNAAGGAGG NNNNNAUG CAA AUU SD 与16S rRNA 3’富含嘧啶的碱基互补配对,对蛋白质翻译的起始非常重要! 3~9 nt 3-11 nt SD序列 : 原核mRNA具有独特的SD序列, 是核糖体结合位点. (r