免疫学第7章抗原抗体反应及应用.ppt

第七章 抗原抗体反应及应用 教学目标和要求：掌握不同抗体的制备的原理与程序；掌握抗原抗体反应的原理；熟悉常见免疫分析方法。 教学重点和难点：不同抗体的制备的原理与程序以及抗原抗体反应的原理。 主要内容 第一节 抗体的制备 第二节 抗原抗体反应原理 第三节 常见免疫分析方法 第一节 抗体的制备 一、基本概念 二、抗血清的制备 三、单克隆抗体的制备 四、基因工程抗体的制备 一、基本概念 1. 多克隆抗体p140：由多个抗原决定簇刺激不同B细胞克隆而产生的抗体。如：抗血清。 2. 单克隆抗体p140：由一个B细胞克隆所分泌的针对一个抗原决定簇的抗体。 3. 基因工程抗体：又称重组抗体，是指利用重组DNA和蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。 4. 催化性抗体(抗体酶)p148：具有催化活性的抗体。 二、抗血清的制备 (一) 免疫动物p141 1.抗原选择 病毒、细菌、其他蛋白质抗原,小分子激素等半抗原必须与大分子载体偶联 抗原的用量：动物种类 2.佐剂及乳化 3.免疫动物 豚鼠、家兔、小鼠、大鼠，大量生产可用羊、马 二、抗血清的制备 (一) 免疫动物 4.免疫途径的选择 免疫动物的途径：动物种类、抗原特性、是否使用佐剂 腹腔注射、肌内注射、皮内注射、皮下注射：任何抗原 静脉注射：可溶性抗原及分散的单细胞悬液，不能使用佐剂 脾脏直接注射、体外免疫：单克隆抗体 二、抗血清的制备 初次免疫后要经过2-3次以上的免疫加强，两次免疫注射之间的间隔一般为2－4周，小动物可间隔10－14天，大动物2个月左右。 二、抗血清的制备 (二)抗血清的纯化与保存 纯化：盐析法：蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低 色谱法: 更高纯度 保存：低温、冷冻干燥 二、抗血清的制备 (三) 抗血清的特性鉴定p142 1. 效价(滴度)：显示抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标，在给定的条件下，结合一定量抗原的抗血清的稀释度。 2. 亲和力（K）：抗血清与相应抗原的结合强度 3. 抗体特异性与交叉反应 三、单克隆抗体的制备 (一) 基本原理 杂交瘤技术（hybridoma technique） 　　即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。 通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。 两种细胞 骨髓瘤细胞 特征：在培养条件下无限分裂、增殖；次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺失 脾淋巴细胞(经抗原免疫) 特征：分泌抗体功能和能够在选择培养基上生长 融合后，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆 (二)单抗制备流程 1. 抗原免疫 抗 原 动物选择 免疫途径选择 皮下免疫 足垫免疫 脾脏免疫－1 脾脏免疫－2 脾脏免疫－3 脾脏免疫－4 脾脏免疫－5 脾脏免疫－6 每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次 第三次免疫之后10天，将小鼠断尾取血，用ELISA方法，检测血清效价。取脾细胞融合前3天加强免疫一次，以活化B淋巴细胞 A ：梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降 5 分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞； B ：钢网研磨法：将脾脏放置不锈钢网（ 100 或 200 目）上，用注射器针芯轻轻研压脾脏，获细胞悬液； C ：酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入 400 u/ml 胶原酶（ III 型） 5ml/ 只脾脏， 37 度消化 20 分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。 骨髓瘤细胞系的选择 要求： 来源应同免疫动物种属一致 自身不产生免疫球蛋白 应为次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶（TK）缺陷型 骨髓瘤的诱生：在小鼠腹腔中注射矿物油 5. 筛选阳性克隆与克隆培养 筛选阳性克隆 目的：产生特定抗原的抗体产生细胞仅占所有脾细胞的5%左右。 筛选方法： 免疫酶技术 ：酶联免疫吸附试验(ELISA) 免疫荧光技术 放射免疫技术 6.杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 对杂交瘤细胞进行染色体分析 应选择染色体数目较多又较集中的杂交瘤细胞 鉴定单