第1讲细胞培养的设施与技术基础1.ppt

   理论：36学时，1,2,3,4,6,8,10,12,13周 实验：18学时， 5,7,9,11周 理论课老师：张伶(柳满然)，陈婷梅， 柳满然 实验课老师：陈婷梅，柳满然 “细胞生物学”与“细胞工程”的区别？ 细胞生物学 是研究细胞的生命活动规律及其机制的基础性学科 研究内容： 在分子、细胞和个体水平上研究细胞的结构、功能、表型及其调控机制； 着重细胞活动的精细分子调节机制及复杂的调控网络研究 细胞生物学：一级学科 细胞工程：二级学科 前沿性：现代生物技术的热点 综合性：多学科交叉 应用性：工程类课程，重在产品与技术 争议性：新技术给伦理道德带来的冲击 发酵工程 酶工程 基因工程 细胞工程 组织工程 蛋白质工程 代谢工程 无菌操作室 培养室 制备室：通常是单独的，对无菌的要求不如上述严格，培养基等的制备 清洗室：器皿等清洗 消毒灭菌室 储藏室：液氮罐、冰箱、培养基、消毒后培养器皿 超净工作台：也称净化工作台 （形成气流屏障）。 常见类型（P9） 侧流式（垂直式，吸气型） 外流式（水平层流式，面向操作者流动，吹气型） 侧流式超净工作台 无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。 操作间放置：超净工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置显微镜等。 缓冲间放置：电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。 二氧化碳培养箱控制中心(包括键盘、显示器、指示器等) 二氧化碳培养箱的结构 1. 恒定的温度:37 ℃ 人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡 培养细胞对低温的耐受力较对高温强 人体细胞在39-40℃ 1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复 当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡 2. pH：7.2-7.4 当pH低于6.0或高于7.6时的生长会受到影响，甚至死亡。 酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂: 酸性培养液呈橙黄色 碱性培养液呈深红色 细胞耐酸性比耐碱性大一些 3. 气体 ＣＯ２有调节pH值的作用。 开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。　 4. 营养—培养基 保证细胞渗透压 培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养成分： 12种必需氨基酸 多种非必需氨基酸 碳水化合物(主要是六碳糖) 维生素 无机盐类 动物细胞培养基的发展过程 天然培养基阶段 合成培养基阶段 无血清培养阶段 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM) 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的 目前已设计出许多种培养基，如DMEM、MEM、IMDM、 RPMI-1640、 M199、Ham12、McCoys 5A等 合成培养基优缺点： 优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要 无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子等 无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成 1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖 无血清培养基的组成及其主要补充成分 （1）激素和生长因子 （2）结合蛋白 （3）贴壁因子和扩展因子 （4）低分子量营养因子 在一些基础研究中，往往影响实验结果 血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用 血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难 胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞 通常：胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟 用含血清培养液可终止其对细胞的消化作用 EDTA是一种化学螯合剂，对细胞毒性小，价格低廉，使用方便 通常与胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，使用浓度见前 注意：使用EDTA 处理细胞后，一定要用Hanks 液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长。 培养液、平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃, 15 磅, 20 分钟