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人ABO血型鉴定和血细胞标本的制备和观察1. 实验内容血型的鉴定。人血凃片标本的制备、观察。人血细胞永久切片标本的观察。2. 实验目的学习巩固显微镜的使用方法。学习掌握人血涂片标本制备的方法，并了解人血细胞的类型和形态。了解血型测定的方法原理，学习玻片法测定ABO血型。3. 实验背景3.1科勒照明：光学显微镜的一般原理科勒照明系统（k?hler illumination）是由德国的动物学家August K?hler于1893年发明的。相对于传统的临界照明（Critical Illumination），科勒照明系统在样品的视野范围内减少了内部散射光，控制了反差和深度，更有效的提供了中心亮视野照明。3.1.1光学显微镜的基本构造光学显微镜的基本结构包括机械、照明和光学三部分（图1，表1）。显微镜的放大作用是由物镜和目镜共同完成的。标本经物镜放大后，在目镜的焦平面上形成一个倒立的实像，再经目镜的进一步放大形成一个虚像，被人的眼睛所观察到。每台显微镜一般有3~4个物镜，可分为低倍镜（如4×，10×），高倍镜（如40×）和油镜（100×）。目镜通常有5×、10×和15×三种。目镜只起着放大作用，而物镜决定显微镜的分辨率。物镜外壳上通常标有放大倍数、数值孔径、镜筒长、盖玻片的厚度和使用条件等性质参数。如标有“oil，N.A.1.30，100×，160/0.17”的物镜表示数值孔径为1.3，放大倍数为100倍的油镜。其要求镜筒长为160 mm，盖玻片的厚度为0.17 mm。数值孔径（Numerical Aperture）是决定显微镜分辨率的最重要参数。图1 LEICA EME型生物显微镜的构造（/）表1 显微镜的基本结构显微镜部分具体部件名称机械部分镜座、镜柱、镜臂、镜筒、物镜转换器，载物台、调节器照明部分光源部分（反光镜或电光源）、聚光器光学部分物镜、目镜3.1.2显微镜的分辨率（1）瑞利极限（Rayleigh limit）：光学显微镜的最大分辨率为0.2 μm。根据瑞利极限计算显微镜的分辨率如下式：d=0.61λ/N.A.(N.A.=n·sinθ)式中，d为分辨距离，单位μm；λ为照明光线的波长；N.A.为数值孔径；n为介质的折射率；θ为物镜镜口角的一半的角（镜口角是通过样品的光线延伸到物镜光孔边缘所成的角）。从式中可见，可通过缩短使用光波长或增加数值孔径来提高分辨率。电子显微镜的光源是比可见光波长短10万倍的电子束，所以其分辨率可达0.2~0.3 nm。可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察，所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的。从公式中可知：提高数值孔径有两种方法，一是增大镜口角，二是增大物镜与标本之间的折射率。采取前一种方法时，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，镜口角总是小于180°，sinθ总小于１。采取后一种方法时，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。因此，油镜的数值孔径较大，分辨率较高。（2）显微镜的放大率：显微镜的总放大率一般为物镜与目镜放大倍数的乘积。总放大倍数要和数值孔径匹配，应在500-1000 N.A.值之间，此为有效放大范围。（3）照明系统对分辨率的影响：聚光器是照明系统中的重要部件，调节不当不但可影响照明的均匀性，还会降低显微镜的分辨率，直接影响图像的反差。因此，在使用显微镜观察标本前，首先需要调节照明系统，主要通过聚光器的调节控制光线照明物体的光锥角度，以得到最佳的分辨率和反差。3.1.3显微镜的使用方法（1）调节照明系统：通过调节光亮调节器、聚光镜的上下位置及虹彩光圈(孔径光阑)使视野内的光线均匀，亮度适中。因其最佳调节很大程度上取决于标本固有的反差特征，所以在观察标本时还要随时调整照明系统，以达到最佳效果。当照明光束与显微镜的光轴不在同一轴线上时，还需通过调节聚光镜中心调节旋钮进行合轴调节（centering adjustment）。调好后，不要再随意调节中心调节旋钮。（2）低倍镜观察：将标本片固定在载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。旋转转换器，将低倍物镜调至光路中央。旋转粗调节旋钮将载物台升起，从侧面注视小心调节物镜接近标本片约5 mm处，然后用目镜观察，慢慢降载物台，直至视野中出现清晰的图像为止。（3）高倍镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，轻轻转动物镜转换器，将高倍镜移至工作位置。调节照明系统后微调细调节旋钮使物像清晰。（4）油浸镜观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域，先用粗调节旋钮下降载物台，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样