实验一 PCR法快速鉴定重组载体.docVIP

实验一 PCR法快速鉴定重组载体 实验目的 掌握PCR法快速鉴定重组载体的基本操作。 实验原理 PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，也可以用来鉴定重组载体，是分子生物学中一项极为常用的技术。 PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。PCR法快速鉴定重组载体的基本原理是直接取沸水浴裂解的重组质粒DNA为摸板，通过特异引物的特异扩增来鉴定外源片段是否重组。 实验内容 仪器和试剂 1．仪器 PCR仪，微型水平电泳槽，电泳仪，水浴锅，离心机等。 2．试剂 （1）50×TAE电泳缓冲液 （2）10×PCR缓冲液： (3) 25mM MgCl2 （4）4种dNTP混和液 2.5mmol/L （5）Taq DNA聚合酶 （5U/μl） （6）引物（20μM） （7）10×溴酚蓝上样缓冲液 方法和步骤 1在 PCR仪上设置好程序。 2在1个灭菌的0.5ml离心管中，按下列顺序加样，建立20μl反应体系。 ddH20 30μl 10×PCR Buffer（无Mg离子） 5μl 25mM Mg离子 3 dNTP(10mM each) 4μl Primer l(20μM) 1μl Primer 2(20μM) 1μl 模板DNA (菌液) TaqDNA聚合酶（5U） 5μl 1μl 总体积 50μl 3混匀，短暂离心． 4放在PCR仪上进行PCR反应。94℃变性3min，94℃15秒，56℃ 25秒，72℃1分钟，35个循环。（用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖约50μl (一滴)液体石蜡油，改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖。） 7 取8μl PCR反应液及1μl上样缓冲液混合，进行1% 琼脂糖电泳(5V／cm)，选择适当大小的DNA分子量标准（DL2000），检查扩增产物。紫外观察，必要时拍照。如果得到与插入片段大小一致的片段，说明已经成功重组。 注意事项 1.PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR前，菌液的充分裂解变性和引物设计尤为重要。 2.Mg2+对Taq DNA聚合酶的活性影响很大，有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时，不妨适当增加Mg2+的浓。实验二 DNA片段的回收及纯化 实验目的 了解琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段的常用方法，掌握根据实际情况选用方法的原则，并用试剂盒从琼脂糖凝胶中回收PCR产物DNA片段。 实验原理 DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，例如可收集特定酶切片段用于克隆或是制备探针，回收PCR产物用于再次鉴定等。回收实验中两个最重要的技术指标是产物的纯度与回收率：纯度未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；回收率不理想时往往会大大增加前期工作量。 1．低熔点胶法 低熔点胶是向普通琼脂糖的多糖链上引入羟乙基形成的，这一变化会使凝胶的熔化点与凝固点均降低。低熔点胶在30℃时凝结、65℃时熔化，这一温度尚不足以使DNA分子变性。操作时可先灌一块普通的胶，然后用低熔点胶取代其中的回收部分。割下的胶加入TE后于65℃保温促使凝胶熔化，再加入等体积的酚抽提去除凝胶。低熔点胶的另一个特点是电泳回收后可以立即进行酶切连接、标记等酶反应，因为这类胶中不含有普通琼脂糖中抑制酶活性的硫酸盐等杂质，并且收集的胶条能在酶反应的合适温度(37℃)始终保持液体状态。 2．玻璃粉(乳)法 将胶条割下加入NaI溶液浸泡，剧烈振荡数分钟促使溶胶。向胶液中加入经酸净化处理的极细玻璃粉(乳)，室温反复倒转离心管使DNA吸附于其上。离心收集玻璃粉后加入TE并于37℃保温，洗脱吸附于玻璃粉上DNA，再次离心收集含DNA的上清液即可。玻璃粉法适用于回收0.4～1kb的小分