第二章细胞的分离与破碎2.pptVIP

预处理--细胞的分离与破碎 2.1 细胞分离 重力沉降 离心沉降 过滤 重力沉降 重力沉降是化工过程中常用的气固、液固和液液分离手段，在生化分离过程中亦有一定程度的应用。 离心沉降 离心类别 离心沉降速度 离心分离法 离心分离设备 离心分离法 差速离心 区带离心 区带离心 区带离心(Zonal centrifugation)是生化研究中的重要分离手段，根据离心操作条件不同，分为 差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation) 平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation) 密度梯度离心（density gradient） 密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用 过滤 过滤速度 过滤设备 细胞外层结构 细胞破碎和产物释放原理 胞内产物释放速率模型 细胞破碎法 机械破碎 化学和生物化学渗透 物理渗透法 机械破碎 高压匀浆 珠磨 撞击破碎 超声波破碎 化学和生物化学渗透 酸、碱处理 化学试剂处理 酶溶 物理渗透法 渗透压冲击法 冻结—融化法 包含体的分离和蛋白质复性 包含体的形成 包含体的分离和蛋白质的复性 思 考 题 酶溶 酶溶法(Enzymatic lysis)利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞壁的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁； 酵母细胞的酶溶需用Zymolyase(几种细菌酶的混合物)、β-1,6—葡聚糖酶(β-1，6-dextranase)或甘露糖酶(mannanase)； 破坏植物细胞壁需用纤维素酶(cellulase)。 化学渗透法比机械破碎速度低，效率差，并且化学或生化试剂的添加形成新的污染，给进一步的分离纯化增添麻烦。但是，化学渗透法比机械破碎的选择性高，胞内产物的总释放率低，特别是可有效地抑制核酸的释放，料液粘度小，有利于后处理过程。 渗透压冲击法 渗透压冲击(Osmotic shock)是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细胞，如动物细胞和革兰氏阴性菌。将细胞置于高渗透压的介质(如较高浓度的甘油或蔗糖溶液)中，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲溶液中。在渗透压的作用下，水渗透通过细胞壁和膜进入细胞，使细胞壁和膜膨胀破裂。 冻结—融化法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结—融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，由于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。冻结—融化法对于存在于细胞质周围靠近细胞膜的胞内产物释放较为有效。 加压叶滤机 加压叶滤机占地面积小，单位容积过滤面积大。相对于板框过滤机，叶滤机在密封条件下过滤，适于无菌操作；但需要足够的空间来更换滤叶和清除滤饼，发酵工厂中常用于啤酒过滤，即垂直叶片硅藻土过滤机。 板框式过滤机：适用于要求滤饼较干的场合，不适用于含挥发性有毒物质或有生物危害的场合。 思考题 1、何谓沉降 2、沉降与离心的异同 3、离心设备可分为哪两大类 4、常用的离心沉降设备有哪些 5、常用的离心过滤设备有哪些 胞外产物：微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、胞外酶、抗生素、多糖等，直接进行固液分离，即可进行滤清液的分离。 胞内产物： 某些目的产物不能分泌到细胞外，留在细胞内部，如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等。 随着重组DNA技术发展，许多有重要价值的生物产品应运而生，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等，基因在宿主细胞内克隆表达成为基因工程产品，其中许多存在于胞内。 分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。 2.2 细胞破碎 2.1.1 细胞壁的组成与结构 动物细胞无细胞壁，只有细胞膜，易于破碎。植物细胞和微生物细胞的细胞膜外还有一层坚固的细胞壁，破碎较困难。 微生物细胞的细胞壁固定细胞外形，保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏。细胞膜主要由蛋白质和脂质组成，二者之和占细胞膜构成成分的80-100%厚度较薄(7～10nm)，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎阻力主要来自细胞壁。 原核细胞 － 组成原核生物的细胞。没有明显可见细胞核，也没有核膜和核仁，进化地位较低。原核生物均为单细胞生物，包括：细菌(狭义)、放线菌、蓝细菌、支原体、立克次氏体和衣原