辐射生物学研究方法课件.ppt

* * Southern简介，DNA杂交 左边图片是个动态图片，全屏时每点一次就会跑一帧 * 转膜的方法，三种，原理后面附上 * 实验步骤 * Northern RNA样品检测 * 图片只是展示一下结果，可以带过 * PCR的定义及原理 * PCR反应体系包括的成分，四种碱基，聚合酶（耐高温），引物，离子（作用：dNTP合成必须，且能促进酶的活性） * PCR实验的大致步骤，右边是文字说明，左边是图解 * RT-PCR：从mRNA开始的DNA扩增，其他步骤与普通PCR相同，就是多了逆转录的过程 * 荧光实时定量PCR 原理，需特定的PCR仪来读取荧光值，从而确定扩增的产物积累 常用的三种荧光 * TaqMan 探针最为常用，原理，R代表荧光基团，Q是使荧光淬灭的基团，他们都被合成在一段与待扩增片段互补的短序列探针上 当探针上RQ同时存在时，不发荧光， * 反应进行时，探针被逐渐取代掉，荧光基团被释放，溶液中可以检测到荧光 根据荧光的量来定量反应的产物 * 研究特定基因功能的方法之一——基因转移 为什么需要外加条件才能实现基因转移 * 研究特定基因功能的方法之一——基因转移 为什么需要外加条件才能实现基因转移 * DNA文库的定义，DNA文库包括基因组DNA文库和cDNA文库 cDNA文库的定义 * 构建基因组文库的基本程序 * 基因组DNA文库构建的示意图 * cDNA文库构建的流程图 * 文库构建后，需要对克隆基因进行验证，验证基因的四种方法 * DNA测序的方法有很多种，这里介绍一种最经典的方法：双脱氧DNA链合成终止法 原理 * 原理示意图 * 常用的功能基因失活的几种方式 * 定点诱变的特色及两种典型的定点诱变的方法 * * * * 体外构建沉默特定基因的siRNA，转入质粒后转染细胞，接下来就是在细胞内部的调控，大致过程前面已经讲过。 * 简介，下张是图解 * * 试验步骤 细胞悬疑——固定——染色——分析 * 周期时相的分布图 * * 工作站捕获的细胞分裂期图像左边的是用差相和微分干涉显微镜头拍到的 右边的是荧光染色后的照片 * 该技术的优缺点 * 电离辐射对DNA分子造成的损伤类型 DSB在辐射生物学中的重要性 * DNA链断裂的类型（单双链）和示意图 * 凝胶电泳的原理，步骤，适合用此方法检测的DNA分子类型 * 彗星实验的原理 * 所需的实验器材 凝胶板，电泳槽，玻片等 * 收集细胞——铺胶（两层凝胶）——细胞裂解——DNA裂解（碱裂解）——电泳——染色——观察 * * 微核的定义，形成原因，微核试验检测的DNA损伤类型 * 试验的原理 * 实验步骤：关键是细胞松弛素(CB)处理细胞两个周期，双核细胞的形成，无着丝点附着的DNA损伤断片便会脱落入细胞质中 * 结果统计 微核率 * 结果展示，箭头指的就是微核 * FISH的简介，早期的放射性标记改进后的技术 * FISH的原理，优点 * 原位杂交的分类 * 实验步骤 * 荧光染色检测DSB 原理：DSB特异性蛋白，抗原抗体免疫荧光染色（右图） * 此页需添加两张照片 * 核算杂交概念，原理 * 杂交原理示意图：高温或者高PH解螺旋——低温或低PH复性。 * 探针的分类 * 探针的分类 * 两种来源的DNA（探针和待测DNA）分别解螺旋，一种吸附在滤纸上，一种分散在溶液中，再将滤纸与溶液结合，DNA会复性后检测与探针结合的DNA * 限制性内切酶，原理，图解的是酶解的过程，特异位点的识别——切割——粘性末端的形成 * 四种限制性内切酶分别识别的位点 * 实验步骤 基因的微阵列分析 DNA微阵列（DNA microarray）又称DNA阵列或DNA晶片，比较常用的名字是基因晶片（gene chip）。是一块带有DNA微阵列（micorarray）的特殊玻璃片或矽晶元片，在数平方公分之面积上分布了数千或数万个核酸探针；检验中的DNA、cDNA、RNA等与探针结合后，通过荧光或电流的改变来探测。一次实验，即可提供大量基因序列相关信息 目前使用的芯片有两种类型 DNA探针的目标物被固定在惰性的固体芯片上 寡核苷酸探针在芯片上原位合成 此外，还有cDNA和mRNA等芯片，已经商业化 辐射生物学研究方法 Westertn Blotting 蛋白免疫印迹（Westertn Blotting）：与southern和northern方法类似，只是被检测物是蛋白质而非DNA或RNA。 该方法中使用的“探针”是与待测蛋白特异结合的抗体，再通过带有第二抗体的底物来显色。 是目前实验室中最长使用的分析蛋白表达的方法。 辐射生物学研究方法 蛋白提取 蛋白变性 凝胶电泳 转膜 一抗标记 二抗标记 底物显色 Westertn Blotting 辐射生物学研究方法 底物的显色方式