免疫组化试验操纵.docVIP

1 仪器设备 （1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉； （2）水浴锅 2 试剂 （1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。 （2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 （3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。 （4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 （5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 （6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 （7）封裱剂： a 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b 油和TBS（或PBS）配制。 （8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 3 操作流程 （1）脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟； 2）无水乙醇中浸泡5分钟； 3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； （2）抗原修复 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。 1）抗原热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。 3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 4）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。 （3）免疫组织化学染色 免疫组化 ( 三步法 ) 操作步骤 ： 　　（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。 　　（ 2 ）、 3%H 2 O 2 室温孵育 5-10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 　　（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。 　　（ 4 ）、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟，倾去血清，勿洗。滴加 一抗 工作液， 37 ℃ 孵育 1-2 小时或 4 ℃ 过夜。 　　（ 5 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 　　（ 6 ）、滴加适量 生物素标记二抗 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 　　（ 7 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 　　（ 8 ）、滴加适量的 辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素 工作液， 37 ℃ 孵育 10-30 分钟。 　　（ 9 ）、 PBS 冲洗， 5 分钟 x3 次。 　　（ 10 ）、显色剂显色 3-15 分钟（ DAB 或 NBT/BCIP ） 　　（ 11 ）、自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。免疫组化实验结果的判定和分析 　　从实验结果而言， HYPERLINK /view/396797.htm \t _blank 免疫组化技术服务主要涉及抗体实验结果的描述与分析，图片的确定与选取，相关数据的提供，上述工作是免疫组化工作的重点内容，只有严格的实验设计，标准的实验操作，专业化的结果分析才能更好的满足客户的要求