生物化学实验：微量凯氏定氮法.ppt

实验内容 一、目的和要求 二、实验原理 三、方法步骤 四、思考题 天然有机物（如蛋白质、核酸及氨其酸等）的含氮量用凯氏定氮法来测定。当天然含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。 测定某一固体样品中的含氮量，是按100克该物质的的干重所含的氮克数来表示（%）。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，在称量瓶中称入一定量的样品，再置于105℃的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重。按上述操作，每烘干1小时后重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重为止。 用量筒向小玻杯加入10mL 40%氢氨化钠，加完后，轻轻地旋转着向上提起棒状玻塞,使碱液慢慢流入反应室，在碱液尚未守全流入时，将玻塞盖紧，向小玻杯中加入约5mL蒸馏水。再轻提玻塞，使一半蒸馏水流入反应室，另一半留在玻杯中水封。 预祝同学们 实验成功！ 生物化学实验 微量凯氏定氮法 一、目的和要求 1. 学习微量凯氏定氮法的原理 2. 掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括 标准梳酸铵含氮量的测定、未知样品的 消化蒸馏、滴定及其含氮量的计算等 二、实验原理 1.RCHNH2COOH + 3H2SO4→2CO2↑+ 2SO2↑+ 4H2O + NH3 2.2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4 消化完成后，在凯氏定氮仪中加入强碱（NaOH）碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量无机酸(H3BO3)溶液中，然后用标准酸（盐酸）溶液进行滴定，准确测定氨量，从而折算出含氮量。 3、(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 +2H2O 4、3NH3 + H3BO3 → (NH4)3BO3 + 3H2O 5、(NH4)3BO3 + 3HCl → 3NH4Cl + H3BO3 本法适用的范围为0.2-1.0mg氮。相对误差应小于±2% 二、实验原理 三、方法步骤 （一）、样品处理  准备4个50mL的凯氏烧瓶，并标号，向第1、2号烧瓶内各加入200mg固体粉末。注意，加入固体样品应加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向3、4号烧瓶加入2mL水，作为空白对照，测量试剂中可能含有的微量含氮物质，以对样品进行校正。 在每个烧瓶中加入约300mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用移液管加入消化液5mL，加入1颗玻璃珠以防止暴沸。将以上4个烧瓶放到消化架上进行消化。 （二）、消化 待消化液变成褐色后，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即完成（固体样品约需3小时）。 （二）、消化 （三）、蒸馏 仪器应先经一般洗涤，再经水蒸汽洗涤。一般洗涤是先用水洗净棒状玻塞周围，每次实验后要洗去氢氧化钠溶液，以防样品加入时立即放氨。使用前全部蒸馏装置必须用水蒸汽充分洗涤。用水蒸汽洗涤蒸馏器的目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。对于处于使用状态的仪器（尤其是正在测定中的仪器），加样前使蒸汽通过1～2min即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸汽洗涤到吸收蒸汽的硼酸-指示剂混合液颜色合格为止。 （三）、蒸馏 1.仪器的洗涤 加样前先撤火1并务必打开夹子，否则，样品会被倒抽到反应器外。取下棒状玻塞，用吸管吸取5mL消化液，细心地插到反应器小玻杯的棒状玻塞的下方。这步必须切实做到，以免加碱后氨立即挥发逸走，让反应液流入反应室中，塞上棒状玻塞，取1只盛有硼酸-指示剂混合液的锥形瓶，放在冷凝器之下口，冷凝器下口必须在硼酸液面之下。此锥形瓶在加碱液（40%氢氧化钠溶液）前或者也可以加样品之前就放在冷凝管下口，并使下口浸入，目的是保证全部吸收氢氧钠溶液与样品接触时放出的氨。 2.样品以及空白蒸馏 2.样品以及空白蒸馏 全部蒸馏完毕后，用0.01024mol/L标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸-指示剂混合液由绿色变回茶褐色，即为滴定终点。 蛋白氮=总氮-非蛋白氮 蛋白质含量（克/%）=蛋白氮×6.25 3.滴定 4、计算 1.指出下列试剂的作用： （1）消化含氮样品时使用的消化液、硫酸钾及硫酸铜粉末。 （2）蒸馏滴定中的40%氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液及2%硼酸溶液中的指示剂。 2.写出以下各步的化学反应式： （1）蛋白质消化 （2）氨的蒸馏 （3）氨的滴定 四、思考题 * *