21基因工程基本概念与工具酶.pptxVIP

2.DNA重组技术与基本操作;基因工程;第一节 基因工程概况;2.重组DNA技术:;3.基因工程：;二、基因工程研究的理论依据是：;三、基因工程的基本过程：?;一个典型的DNA重组实验通常包含以下几个步骤：;;（二）基因工程上游操作的基本过程;（二）基因工程上游操作的基本过程;（二）基因工程上游操作的基本过程;（二）基因工程上游操作的基本过程;（二）基因工程上游操作的基本过程;（二）基因工程上游操作的基本过程;四、 基因工程的四大要素;五 基因工程的支撑技术;六、重组DNA技术与基因工程的基本用途;第二节 DNA重组与工具酶 ;一、DNA;bp、 kb、Mb：;二 基因工程的工具酶;（一） 限制性内切核酸酶（restriction endonuclease）;1 限制性核酸内切酶的发现;1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性酶;2 限制性核酸内切酶的生物功能;3 限制性核酸内切酶的命名;4 限制性内切酶的类型;5 II 型限制性核酸内切酶的基本特性;EcoRI等产生的5′粘性末端;PstI等产生的3 ′粘性末端;PvuII等产生的平头末端;同裂酶（Isoschizomers)：有一些来源不同的限制性内切酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶，如HpaⅡ和MspⅠ，BamH I和Bst I分别是一对同裂酶。 产生同样的切刻，形成同样的末端 同尾酶(Isocaudamer)：与同裂酶对应的一类核酸限制性内切酶，它们虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，特称之为同尾酶。如BamHⅠ,BclⅠ,BglⅡ,Sau3AⅠ和XhoⅡ是一组同尾酶。;6 影响限制性核酸内切酶活性的因素;2）DNA样品的甲基化程度：;3）核酸内切酶的缓冲液性质：;4）核酸内切酶的反应温度：;7 限制性内切酶酶切DNA的方法;7 限制性内切酶酶切DNA的方法;8 类型Ⅱ限制性内切酶的主要用途;;练习：根据以下描述绘制限制性内切酶图谱;;2）产生新的嵌合DNA分子（ DNA的连接）;;（二） DNA连接酶;注意：;①裂口（Gap）：单链的裂口，是双链DNA分子上某一条链失去一个或连续数个核苷酸所造成的单链断裂，称DNA的Gap。 ②缺口（Nick）：是双链DNA分子上的单链断裂，是由相邻两个核苷酸之间失去磷酸二酯键所造成的单链断裂，称DNA的Nick。;2 DNA连接酶的三个条件：;3 DNA连接酶的基本作用;2??修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键;3）连接多个平头双链DNA分子：;平头双链DNA片段的连接操作;平末端DNA的连接方法：;提高平头末端连接效率的方法包括：;（三） DNA聚合酶;DNA聚合酶催化的反应;5种： DNA聚合酶 I 、II、III、Ⅳ、Ⅴ;1 大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ）;缺口平移标记法;2 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ）;Klenow酶的基本用途：;Klenow酶补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端;Klenow酶的基本用途： DNA片段的同位素末端标记;3 依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）;（四）核酸外切酶;（四）核酸外切酶;双链核酸外切酶：λ核酸外切酶（ λ Exo） λ核酸外切酶特异性地从5‘ 端外切 ;（五）单链核酸内切酶：S1核酸酶;S1核酸酶的主要功能：;S1核酸酶的主要功能：;;（六）末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）;TdT的基本特性：;来自小牛肠的碱性磷酸单酯酶（CIP）;;小结：二 基因工程的工具酶;三 DNA片段的连接重组;同种内切酶产生的粘性末端的连接;同尾酶生产的粘性末端的连接;不同粘性末端的连接;人工粘性末端的连接 5‘突出末端;人工粘性末端的连接 3‘突出末端;人工粘性末端的连接 平头末端;粘性末端的更换;重组率;提高重组率的方法;提高重组率的方法;小结;思考题：