5第五章原核生物的基因工程.pptxVIP

第五章 原核生物中的基因工程 ;利用原核生物细胞进行基因工程操作的优越性： 1.原核生物结构相对简单，代谢途径和基因表达调控过程相对清楚； 2.易于操作和大规模地培养； 3.将一种原核生物的基因克隆后转移到另一种原核细胞中表达，可获得有活性的基因产物，并形成特定代谢物合成途径。由于原核生物种类繁多，真核细胞所有的基因产物几乎在原核生物中都能找到，因此原核表达系统生产基因工程产物非常有前途。 4.目前应用最多的是大肠杆菌，其基因组测序完成，其中有相当多的基因已经被鉴定,是目前应用最多的原核生物表达系统。; 目前的基因工程产品有相当多是原核生物表达体系获得的。如基因工程胰岛素；干扰素;基因工程疫苗；诊断试剂，包括分子生物学中的工具酶，如限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、DNA连接酶；逆转录酶等等。 有些真核生物基因在原核细胞中的表达并不能成功，主要原因有： 1.不能形成其天然构象； 2.没有真核细胞的蛋白合成和加工系统； 3.内源性蛋白酶会降解一些构象不正确的异源蛋白； 4.内毒素会影响蛋白产物在人体中的应用。; 一、影响外源基因在大肠杆菌中 高效表达的因素 外源基因在大肠杆菌中高效表达的主要控制因素包括：提高表达产物的表达量；抑制蛋白酶对表达产物的降解作用和恢复蛋白质的特异空间结构。 决定蛋白表达水平的因素主要有：启动子的效率；SD序列；密码子的频率；终止子的效率；质粒的拷贝数。;（一）启动子;2.常见的启动子：;3.启动子的最佳距离 在大肠杆菌细胞中，多数启动子与转录起点之间的距离约为6-9个碱基，但对外源基因的表达这并不是最佳的。最佳的启动子距离用克隆方法解决。 ;启动子最佳距离的筛选质粒构建;4.启动子的可控性 重组基因表达后，会对宿主细胞的生长有抑制作用。所以一般是将工程菌的生长和蛋白的表达分离。先让菌体数量增长，然后再诱导物（IPTG,异丙基-?-D硫代半乳糖苷） 重组基因的表达，并且诱导的时间不能太长，否则表达水平也不高。 ;现在最常见的是大肠杆菌的Lac Z 启动子：;PL启动子采用双质粒表达系统;How dos T7 promoter work？;（二）、SD序列 原核生物的mRNA的5‘端都有一段SD序列，这一段序列与核糖体小亚基上的16sRNA的3’端序列互补，作为翻译识别序列。;（三）、终止子： 外源基因在强启动子的作用下会转录过头，产生长短不一的mRNA。这回带来以下影响： （1）过长转录消耗较多的时间和能量； （2）过长转录影响下游某些功能区，如复制起点，选择标记等的功能，甚至导致重组质粒不稳定； （3）产生不必要的蛋白，消耗能量； （4）过长转录导致不正确的二级结构，降低翻译效率。 因此，在外源基因的下游，通常要接上终止子。;终止子的筛选： 将DNA序列插入启动子与四环素抗性基因之间，在四环素培养基中不能生长，在Amp培养基中能生长的克隆为候选克隆。;（四）.密码子使用频率 不同生物以致同种生物不同蛋白使用兼并密码的频率是不一样的，其原因： （1）不同生物细胞中碱基的组成； （2）密码子与反密码子相互作用的自由能差异； （3）细胞内tRNA的含量。;（五）质粒拷贝数 ; 由于细胞中质粒拷贝数增加会影响细胞的生活力，所以不希望质粒数在任何时候都高，希望构建一种拷贝数可控的质粒。 pCP3质粒是将含强启动子PL的质粒pPlc2833，将pKN402上的温度敏感型复制序列转移到该质粒上即构建成pCP3质粒。 重组后的质粒的拷贝数对温度的敏感性加强。;温度敏感控制型质粒;二、大肠杆菌中蛋白表达方式;（一）包涵体异源蛋白表达;1.包涵体的性质 包涵体的组成有3部分： 大量表达的外源蛋白（50%）； 细胞内高表达蛋白，如RNA聚合酶，核糖核蛋白体和外膜蛋白； DNA/RNA和脂多糖。 包涵体在相差显微镜和电子显微镜下可见，因此又叫光折射体。 ;从包涵体中纯化蛋白的好处是： 1.利用其较高的密度，用高速离心机离心获得包涵体颗粒，实际上起到了初步纯化的作用； 2.形成包涵体后，不易被细胞内的蛋白酶降解。 不利因素： 1.洗脱时有一些损失； 2.包涵体一般没有活性，需要变性后再复性时需要高浓度的变性剂，在复性之前，需要通过透析方式出去这些高浓度的变性剂，使操作难度增大。;2.包涵体形成机制 （1）折叠状态的蛋白质聚集作用，由于高速表达蛋白质形成的结构是随机折叠的，二硫键多数是错配的，其构象是不正确的，错误构象的蛋白溶解度极低，易于生成包涵体。 （2）非折叠状态的蛋