TMA的原理及应用.ppt

Procleix Ultrio Assay Step 3: Chemiluminescent Detection HIV-1 HCV IC glow glow flash Add detection reagents HybridizeAE label probes Hydrolyze AE unhybridizedprobes RNA扩增子 HBV 检测发光 杂交保护 双动力学检测 glow Procleix Ultrio Assay Step 3: Detection — Dual Kinetic Assay (DKA) 0 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 0 0.5 1 1.5 2 Flash (IC) Glow (viral analyte) Relative light unit Time (seconds) Procleix HBV Discriminatory AssayStep 3: Chemiluminescent Detection HIV-1 HCV IC Measure light emission flash HBV glow Add detection reagents HybridizeAE label probes Hydrolyze AE unhybridizedprobes RNA扩增子 Procleix HIV-1 Discriminatory AssayStep 3: Chemiluminescent Detection HIV-1 HCV IC Measure light emission glow flash HBV Add detection reagents HybridizeAE label probes Hydrolyze AE unhybridizedprobes RNA扩增子 Procleix HCV Discriminatory AssayStep 3: Chemiluminescent Detection HIV-1 HCV IC Measure light emission glow flash HBV Add detection reagents HybridizeAE label probes Hydrolyze AE unhybridizedprobes RNA扩增子 TMA与PCR比较 TMA PCR 扩增原理 模拟自然 DNA 转录成 mRNA 的过程 模拟自然 DNA复制的过程 靶目标 RNA DNA 酶 MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶 DNA聚合酶 反应体系 两种酶，两条引物，dNTP, NTP 一种酶，一对引物，dNTP 温度条件 恒温（41.5℃ ） 循环导热 （变性，退火，延伸） 扩增仪器 水浴箱或者加热块 热循环仪 扩增产物 RNA DNA 扩增速度 每个循环可以生成100-1000个复制物，在15-30分钟内可增加10亿倍复制物 以2n扩增，2～3 h就能将待扩目的基因扩增放大10亿倍 TMA的优点 缺点 易于自动化 灵敏度高 扩增效率高：10n 不能绝对定量 基因型 95% LOD (95% CI)（IU/mL） 50% LOD (95% CI)(IU/mL) HCV , b 18.4 (11.1-41.3) 4.5 (2.9-7.1) HCV 2b 15.3 (8.7-36.9) 2.8 (1.7-4.6) HCV 3 28.3 (14.8-75.2) 3.6 (2.1-6.2) HCV 4 29.0 (16.5-70.8) 5.6 (3.6-9.1) HCV 25.5 (13.8-64.4) 3.9 (2.3-6.5) HCV 32.6 (18.6-76.6) 6.4 (4.0-10.2) HIV 42.2 (25.3-95) 9.3 (4.4-42) HIV-1 B 48.2 (26.9-119) 8.8 (5.5-14.4) HIV 17.5 (9.2-47) 2.1 (1.3-3.6) HIV-1 D 19.9 (10.4-51.2) 2.3 (1.3-3.9) HIV-1 E 20.8 (11.0-54) 2.9 (1.7-5.12) HIV-1 O 38.8 (19.4-113) 3.9 (2.2-6.9) HBV A adw2 195 (99.7-525) 20.7 (11.9-36.0) HBV B ayw1 90.7 (45.2-248) 7.9 (4.5-14.0) HBV C adr 72.1 (38.8-179) 9.8