第3章氨基酸分离分析.ppt

第四节 氨基酸混合物的分析分离 p148 一、分配层析的一般原理 层析即色层分析又称色谱(chromatograph)。所有层析系统均有两相组成： 固定相(stationary phase) 流动相(mobile phase) 混合物在层析系统中的分离决定于各组分在两相中的分配。 1891年Nerst提出分配定律：当一种溶质在两种互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比为一常数称为分配系数(Kd)。 物质不仅在互不相溶的两液相间分配，也可以在固相-液相间或在气相-液相间分配。 层析系统中的固定相可以是固相、液相或固-液相混合相（半液体）；流动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中，并能流过静相。 某一物质分配不直接决定于它的分配系数(Kd)，而取决于它的有效分配系数Keff 。 Keff差异越大的物质越容易分开。 二、 分配柱层析装置 设想的板层：固+流 柱层析：层析柱中的填充物（支持剂）都是一些具有亲水性的不溶物质：纤维素、淀粉、硅胶等。它们吸附一层不流动的结合水，可以看作固定相，流过的互不溶的溶剂是流动相。 纸层析：滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的溶剂是流动相。混合氨基酸在这两相中不断分配而被分布在滤纸的不同位置上。只要实验条件确定，每种氨基酸的相对迁移率恒定。分离、鉴定氨基酸的常用技术。 氨基酸的双向纸层析图谱 纸层析中的Rf值（相对迁移率） Rf= 四、薄层层析——纤维素粉、硅胶和氧化铝粉 分辨率高、所需样品量微 五、离子交换柱层析 磺酸型阳离子交换树脂（支持剂） 离子交换柱层析——自动化 离子交换——自动分析仪 洗脱的先后顺序取决于氨基酸的所带电荷与离子交换树脂的静电吸引和疏水相互作用两者的综合作用的结果 气相色谱 氨基酸与异硫氰酸苯酯反应生成PTH-氨基酸，然后经三甲基硅烷基化，得到易于气化的氨基酸衍生物。 高效液相色谱(high performance liquid chromatograph，简称HPLC)又称高压液相色谱 * Keff = 某一物质在动相中的总量 某一物质在静相中的总量 Keff = CA x VA CB x VB Keff = Kd×Rv(A,B两相的体积比) 洗脱液 圆形滤纸，以免扰乱表面 填充物 固 尼龙网格、烧结玻片或其他支持物 尽可能小的死体积 分部收集管 连接保持恒压力的洗脱液池（溶器） 酚-甲酚-水 丁醇-醋酸 + 原点 三、纸层析 X Y 溶剂前沿 氨基酸显色点 滤纸 原点 盖子 层析缸 层析板 溶剂 离子交换树脂（支持剂）。含酸性基团或碱性基团，解离出H+ 或OH-与被分离物中相应的离子交换而“挂”在树脂上。 样品注入口 泵 洗脱液 流出液/ml 连接记录仪 储液缸 过滤器 压力泵 进样室 检测器 收集器 记录仪 恒温装置 层析柱 *