电生理研究方法.ppt

Bernstein膜学说 1902年，Bernstein提出生物电发生的膜学说： “神经或肌肉的细胞膜只对钾离子有特殊的通透性，而对较大的阳离子和阴离子则均无通透性，因此由于细胞内外钾离子分布不均匀，在膜两侧就形成一个电位差，此即静息电位，神经冲动到来时，膜变为无选择通透的膜，静息电位消失，动作电位因而产生。” 离子学说（动作电位的钠学说） 1940年前后，由于Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨轴突上发现动作电位大于静息电位的事实，Bernstein膜学说受到了有力的打击。以后的研究证实， Bernstein膜学说对于离子通透性的假设是不正确的。其被后来的离子学说（钠学说）所代替。 离子通道等效于电导 贴附式记录（ Cell-attached recording） 内面向外记录（Inside-out recording） 外面向外记录（Outside-out recording） 全细胞记录（Whole-cell recording） 蛙坐骨神经元单个Ranvier结的电压钳记录 （四）几种电压钳方法 双微电极法 单蔗糖间隙（Singe Sucrose Gap ）法 双蔗糖间隙（Double Sucrose Gap）法 电极接触细胞 负压吸引形成Ω形膜囊泡 提起电极，囊泡与细胞脱离 A B C D 第三节 膜片钳制技术 膜片钳制技术（patch clamp technique)是对一块单独的细胞膜片（或整个细胞）的电位进行钳制的一项电生理技术。 通过对膜电位的钳制可以观察通过离子通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。 一 基本原理 膜片钳的本质属于电压钳范畴，其基本工作原理是：采用经典的负反馈放大技术作电压固定，但改用细胞外微吸管作电极，将微电极管尖端与细胞膜表面接触，经负压抽吸，形成具极高阻抗的紧密封接，其电阻值高达10-100千欧（即GΩ=109Ω）。只有在这种封接存在时，通过膜电极引导记录的电流才是通过该膜的离子通道电流。 膜片钳技术原理示意图 Rs是膜片阻抗相串联的局部串联电阻（输入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常为1～5MΩ，如果Rseal高达10GΩ（1010Ω）以上时，IP/I=Rseal/(Rs+ Rseal)-1。此Ip可为在I－V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻(Rf)的电压降而被检测出。 膜片钳与电压钳的区别 膜电位钳制的方法不同； 电位固定的细胞面积不同； 研究的离子通道数目不同； (1) 测量部分： (2) 串联电阻补偿部分： (3) 电容补偿部分： (4) 指令信号控制部分： (5) 电源部分： 膜片钳放大器主要组成: 电极电流监视器、灵敏度开关、滤波器开关、方式选择开关 。 用于校正全细胞记录时，由于电极和细胞内之间的通路电阻所造成的膜电位误差 。 用来补偿电压突然改变 时引起的电容电流 。 将一定的电压加入到刺激信号中，形成一指令信号的保持电压。进行电压钳制时，它决定膜电位值，作电流钳制时，则决定电流值 。 提供放大器各部分的电源 。 贴附式 全细胞记录模式 负压吸 内面向外式 外面向外式 拉 细胞 细胞 细胞 细胞 拉并暴露于空气中 四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode) 细胞贴附式膜片（cell-attached patch） 优点：不破坏细胞的完整性，不需要胞内灌流，不影响细胞质且调制系统完整。可研究通过细胞对单通道的调制，也可在正常离子环境中研究递质和电压激活的单通道活动。 缺点： 不能改变细胞内成分，也不能精确测定膜电位。同时由于许多细胞膜上存在有牵张激活的离子通道，细胞膜与电极间轻微的张力变化往往会增加记录的背景噪声。 由于细胞牢固贴附于微管电极的尖端而得名。它可用于记录各种细胞的单通道电流，而且是在细胞完整无损的状态下研究通道的活动。 细胞 电极 细胞膜 胞外液 胞内液 内面向外式膜片 (inside-out patch) 细胞贴附式膜片形后，提起电极时，与电极尖端相接的细胞膜被撕脱下来开成小泡，将电极尖端在空气中暴露几秒钟后小泡很快破裂，形成胞浆侧向外的内面向外式膜片。 特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡形成。 应用：