细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳.pptVIP

线粒体的改变 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测 缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。 凋亡的生理学意义 发育 凋亡的生理学意义 清除自身感染或变异的细胞 细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳 细胞凋亡（apoptosis/programmed cell death） 细胞凋亡是为维持内环境稳定，一个由基因控制的主动的有序的死亡过程，凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。 生物学意义： ①确保正常发育生长：清除多余的细胞 ②维持内环境稳定：清除受损、突变、衰老的细胞 ③积极防御功能：对病毒感染细胞阻止复制 细胞凋亡过程中的形态学改变 细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离。 细胞质密度增加，线粒体膜电位消失，通透性改变，释放细胞色素C到胞浆。 核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA降解成为约180bp-200bp片段。 凋亡小体形成。但无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。 其中最重要和最具有特征性的改变是Ca2+/Mg2+依赖性的核酸内切酶的激活而导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180~200 bp为最小单位的单体或寡聚体片段。 凋亡和坏死的区别 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞 胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。 凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。 凋亡和坏死的形态学特征 凋 亡 坏 死 单细胞或一小群细胞 相邻的细胞团 细胞皱缩和卷积 细胞肿胀 核固缩和和碎裂 核溶解 完整的细胞膜 破坏的细胞膜 细胞质保留在凋亡小体 细胞质释放 无炎症 一般都存在炎症 实验原理 本实验是利用琼脂糖凝胶电泳分析小鼠胸腺细胞DNA在地塞米松诱导下细胞的凋亡现象。凋亡细胞染色质DNA在核小体连接处断裂，形成180-200 bp或其整倍数的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯状电泳图谱(DNA ladder)，而坏死细胞或凋亡后期的继发性坏死细胞DNA电泳后则成模糊的“涂片状” 。 材 料 1. 凋亡细胞：经地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞 2. 提取DNA：基因组DNA抽提试剂盒（RNA酶、蛋白酶K、悬浮液、裂解液、洗涤液、洗脱液、DNA ladder 标准品等） 3. DNA电泳：1 %的琼脂糖凝胶、点样缓冲液 4. 实验器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、台式高速离心机、65℃水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、紫外透射仪 方 法 一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨，将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm，离心5min，制成1×107细胞悬液备用。 二、提取胸腺细胞DNA： ⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、RNaseA/蛋白酶K液=A液） 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。 (2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、3MNaAC, pH4.8) 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟，12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次同上，静置1分钟，离心30s。 (3)漂洗阶段（使用试剂：600ul漂洗缓冲液×2=W液） 倒掉收集管中的废液，再加入600ulW液，12000rpm离心30秒。 重复上叙步骤，再次加入600 ulW液，12000rpm离心30秒。 倒掉废液，再次12000rpm离心30秒。 (4) 洗脱收获（使用试剂：50μl洗脱缓冲液=T液） 小心取出离心吸附柱（不可沾上W液，因其中含有乙醇，会使提取DNA变性），将其套入一个干净的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中间小心加入50μl T液，静置1分钟后，于12000rpm离心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因组DNA, 取10μl电泳。 三、DNA琼脂糖凝胶电泳： (5)制板: 将1 %的琼脂糖凝胶加热溶化，取20ml倒板, 待凝, 取梳。置板于电泳槽中，加电泳缓冲液至淹没过胶。 (6) 加样：取50 uL D