ZBL- 生物化学 第五章 蛋白质化学(5-13节).ppt

测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的（纯度大于97％）而且是已知分子量的蛋白质。一般的测定步骤是： 拆开肽链内部的二硫键。（β-巯基乙醇、二硫苏糖醇） 2. 通过末端分析确定蛋白质分子由几条肽链构成。 3. 将每条肽链分开，并分离提纯。可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链。 4. 肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成和比例。 5. 肽链的另一部分样品进行末端鉴定。（二硝基氟苯法（FDNB）测N端；肼解法测C端。） 6. 肽链降解成一套大小不等的肽段，将各个肽段分离并测序。 7. 再用另一种部分水解方法水解成另一套肽段。 8. 用Edman降解等方法测定各肽段氨基酸顺序，比较两套肽段的氨基酸顺序，利用不同肽段的AA顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的AA顺序。 9. 测定原来的多肽链中二硫键和酰胺基的位置。 1. 末端分析 （1）N末端测定 ① 二硝基氟苯(DNFB)法Sanger法 DNFB在弱碱性溶液中与肽链末端自由氨基反应，生成黄色的二硝基苯基蛋白质（DNP-蛋白质），酸水解后生成DNP-AA和其它氨基酸混合物，再用色谱分析鉴定氨基酸种类。 ② 丹磺酰氯法比DNFB法灵敏100倍。 丹磺酰氯是一种强荧光剂，可用于测定肽链的氨基末端，它能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。 ③ 异硫氰酸苯酯(PITC)法 又叫 Edman降解法。此法在pH9．0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，生成相应的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH –AA），最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH-AA种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。 优点：是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。 特点：从N-端依次对氨基酸进行鉴定。 （2）C末端测定 ① C末端氨基酸可用硼氢化锂还原生成相应的α氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。 ② 肼解法。多肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。 ③ 羧肽酶法更常用： 将蛋白质在pH 8.0, 30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。 羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。 一般情况下，蛋白质分子中肽链的数目应等于N末端氨基酸残基的数目，可根据末端分析来确定一种蛋白质由几条肽链构成。 必须设法把这些肽链分离开来，然后测定每条肽链的氨基酸顺序。 如果这些肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。 如果肽链之间以二硫键交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇等。 二硫键拆开后形成的不同肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。 （1）部分酸水解：限制水解时间、酸强度、水解温度 （2）用溴化氰处理，可断裂甲硫氨酸的羧基形成的肽键。水解后甲硫氨酸残基转变为C末端高丝氨酸残基。 胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶：前者水解疏水残基之间的肽键，后者水解疏水残基的氨基形成的肽键。 金葡菌蛋白酶：又称谷氨酸蛋白酶或V8蛋白酶，水解谷氨酸和天冬氨酸的羧基形成的肽键。在醋酸缓冲液中只水解谷氨酸，在磷酸缓冲液中还可水解天冬氨酸。 梭状芽孢杆菌蛋白酶：水解精氨酸羧基形成的肽键。 一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，2－4小时即可完成。 一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。 常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。 一级结构：肽键、二硫键 三维结构：氢键、疏水作用、范德华力、离子键、配位键 肽键 一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基缩合失去1分子水后形成的化学键。 二硫键 酯键 配位键 氢键 离子键 范德华力 疏水作用 第六节 蛋白质的二级结构 二面角 二面角决定肽链的构象 第七节 蛋白质的三级结构 肌红蛋白 肌肉中用来储存氧，心肌中含量特别丰富。 抹香鲸每千克肌肉中含80克肌红蛋白，比人高10倍，所以其肌肉呈棕色。 由4个亚基构成一个四面体构型，每个亚基的三级结构都与肌红蛋白相似，但一级结构相差较大。 成人主要是HbA，由两个α亚基和