PCR产物测序.PDF

千年基因 PCR产物测序 PCR产物测序可以鉴定不同个体中同一个基 具体步骤 因的差异，应用最广泛的是宏基因组16S rRNA DNA模板（浓度100ng/μL, 体积20μL, 测序。16S rRNA含量大、分子量适中，可以对 OD260/280=1.8-2.0 浓度最好Qubit或PicoGreen 特定环境下的细菌和古菌群体的微生物种类和 定量）； 丰度进行有效的鉴定。 根据提供的目标基因上下游引物，合成tagseq 实验方案 引物； 主要流程为将待测序的样本同时加上测序 梯度PCR 确定最适合的反应条件； 引物，并且每个样品带上特异的序列标签。测 样本批量PCR 序后根据标签序列分开不同样品的序列。 每个样本独立胶回收； Qubit准确测定浓度后，同一总量混匀样品； 平台推荐 混合样品Qubit定量及电泳确定； 根据研究的目的不同，可以选择454或者 测序。 Illumina平台进行后期测序。在前期样本制备 过程中PCR产物测序均需要多个样本分别加标 信息分析 签混合，考虑到每个样本的丰度及数据量等， 基本信息分析：按标准流程进行base calling 我们建议454平台最多混150个样本/run ， 及raw data数据整理、数据质量评估； Illumina平台每个lane最多可以混150个样本。 根据MID区分并整理不同样品的序列； V3和V4 区的检测 物种组成分析（与RDP、Silva、GreenGene等 16S核糖体RNA的序列是由9个可变区和10 数据库比对）； 个保守区组成，其中很多微生物的16S序列通 alpha及beta多样性统计（软件Mothur、 过多个数据库已经可以查到，所以利用V3和V4 QIIME等）； 可变区的测序可以将待研究的物种进行分类。 群落组成与理化参数之间的相关性分析（ 对于读长比较长的454平台，我们建议V3和V4 ABT 、MRT等）； 区同时检测；对于Illumina平台，我们建议测 根据具体研究进行的细节分析。 V4 区。 AGCTGGATTTGAAATACACCCTCAGGAGGCCTTAGCTGGATCCTGGATTCTGGATTCTGGTGAAATACACCCTCAGGAGGGCCTTAGCTGGATTTGAAATTTCAGACT CCTTAGCTGGATTTGAAATACACCCTCAGGAGGCCTTAGCTGTTAGCTGTTAGCTGTTAGACCCTCAGGAGGCCT