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克隆表达与引物设计 * 动物医学院专题讨论 Clone,Expression,and Prime Design 克隆表达的路线 目的DNA片段和载体的连接 目的DNA片段和载体的制备 连接产物的转化 重组子筛选 目的蛋白的诱导表达 目的蛋白的纯化 表达的目的 载体的选择 引物的设计是关键 什么是克隆？ 目的基因的克隆及其原核表达 技术路线 RNA Extraction Vector T Vector T PCR Product A A pET -HE HE HEV RT-PCR 转化DE3 HE蛋白 ITPG诱导 大肠杆菌 1. 明确实验的目的，根据实验目的设计引物。 2. 选择表达载体，根据载体的酶切位点，在引物的5‘端加入酶切位点。 3. 分析所要扩增的基因片段，对其保守性，抗原优势位点等进行分析。 4. 利用软件，参照引物设计的原则，进行引物的设计。 实验目的与引物设计 PCR引物设计的目的： 找到一对合适的核苷酸片段，使其能够有效的扩增模板DNA。 引物设计目的和PCR扩增 引物 常用PCR扩增的体系（25μL）和条件 程序： 95℃ 变性5min；94℃ 变性30s， 52℃ 退火30s， 72℃延伸40s， 30 个循环； 72℃延伸10min 0.5μL Taq 酶 2μL 模板 1μL 下游引物 1μL 上游引物 1μL dNTP 2.5μL 10×buffer 17μL ddH2O → ← 3’ 3’ 5’ 5’ Sense primer Antisense primer 引物设计的原则 1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 2. 产物不能形成二级结构；避开产物的二级结构区。自由能△G°≥58.6l kJ/mol。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。 5. 碱基要随机分布。 6. 引物自身不能有连续4个碱基的互补；引物之间不能有连续4个碱基的互补。 7. 引物5′端可以修饰；引物3′端不可修饰。 8. 引物3′端要避开密码子的第3位。