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电转化注意事项(国外英文资料) 电转化注意事项 作者: global.wun (站内联系ta) 发布: 2009 - 10 - 20 一、 制备感受态的菌液收集时间: 1、准确测定od值: od在1.2～1.5之间. (1) 为了准确测定od值, 建议将菌液稀释不同浓度测定 1、2、4、8、16倍稀释, 看其od值是否呈线性关系).每个倍数做3－5个重复, 应该可以大致推断od值是否准确! 菌液看上去浑浊, 但od值不高, 很可能od稀释倍数不够! 2) od值是否测准也可以这样估算: od600为40左右时, 菌体湿重 (6000rpm离心5min) 约 0.95g / 10ml.高密度发酵时菌体湿重将相应下降. 2、75ml的菌, 经18h左右的培养, 最后sorbital洗涤完毕后, 50ml离心管里所剩菌体特别浓, 需要1ml sorbitol才可溶解为糊状.正常培养的od在1.2～1.5之间的500ml菌液, 收集的感受态也用1ml稀释的, 没那么粘稠.可以看看降低培养温度 (27摄氏度) 或缩短培养时间 (12h). 3、甚至不用转接, 直接挑单克隆在50－100mlypd中摇过夜, 效果也很好 二、制备感受态的菌液量 如果只转一个样品, 50ml就够了, 一般50ml的培养液如果od值正常的话够做10管感受态的, 其他的按比例缩小.用大试管摇5ml菌液, 然后取1ml毫升在1.5mlep管中制感受态, 每一步的离心时间30秒就行.整个流程时间短, 制备好的感受态用来做转化的效率很高. 山梨醇离心, 洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度, 不要过于粘稠和稀释. 三、感受态的保存 感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因, 在冰上放几个小时再做可能有一定的影响, 尽量马上制备马上转化.如果感受态细胞要保存, 不需要加甘油, 一般80ul ep管分装 -, 70 - 80 摄氏度保存 或. 另附: 酵母gs115点种分离纯化 接种gs115于5ml ypd液体培养基, 30℃, 200rpm振荡过夜, 涂布 ypd平板, 30℃培养48 小时, 用 ynb基本培养基和含his的补充培养基作点种分离纯化, 挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划ypd平板, 4℃保存. 四、电转化注意点: 1、感受态做好后, 最后一次吸出sorbital时, 不是直接倒调的, 而是用毛细管轻吸出来的, 这样可能使剩下的感受态纯净些. 2、最后用毛细管取出100ul出来, 加入质粒, 混匀! (怕量不够, 吸得很多, 电转时效果反而不好.) 3、电转杯清洁处理: 一般先冲洗, 洗净; 然后浸泡在75% 的乙醇中; 使用前我们都是放在超净台上, 开启紫外, 边吹风晾干, 边进行紫外照射.电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响. 4、电击的时候, 电压数以及电击时间可以摸索一下, 适当增加电压或者延长电击时间都可以.电击条件比如1.5kv, 放电4.8～5.5ms.电击所有过程都要尽量在冰上进行, 电击时间可以减少一点, 设置为5ms左右, 电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液, 转移至ep管, 30度静止培养1h.如果菌体悬液浓度比较大的时候, 在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了. 5、电击之后, 加入1ml的山梨醇, 吸入1.5ml的ep管中, 置于30度摇床低速培养1h, 再涂板. 6、注意的是处理液中的dtt是在使用前加入, 其它配好后于4度保存, dtt单独于 - 20度保存, 可配成100倍的贮备液. 7, after the conversion of 1ml with sorbitol suspending cell suspension can not be completely coated on a board, according to the standard procedures produced by the competent general about 3 may be more appropriate, to see a thin layer of dried white light. The transformants produce round, plump, large colonies on the white layer. Five. Correct preparation methods of conversion reagent and culture medium 1, MD board in advance a few days to do, put in the refrigerator, coated board when the absorption