谭西20135213基因工程作业.docVIP

生命科学与工程学院 大学生创新实践项目申请书 项目名称：茶树多酚氧化酶的基因克隆与真核表达 p 申 请 人： 谭西 p 专业班级 p 学 号： p 联系电话： p 申报日期： 2015 年 12 月 23 日 一、项目基本信息 多酚氧化酶（PPO）是一类广泛存在于植物体内能催化多酚类氧化成醌类的含铜质体金属酶。茶树PPO对茶叶品质的形成起关键作用,尤其与红茶品质的形成更是密切相关。茶树PPO除可应用于提高红茶品质外,还可应用于制备茶黄素及酚类废水治理等方面的研究。本课题选用国家级茶树良种迎霜为材料,以鲜叶基因组DNA为模板,克隆茶树PPO基因,并进行真核表达,以获得具有生物活性的茶树PPO工程蛋白酶,为应用于红茶加工以及茶黄素的生产等方面提供实验基础。 二、立项依据 多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一类广泛存在于植物体内能催化多酚类氧化成醌类的含铜质体金属酶（宛晓春，2003）。在茶叶加工过程中，多酚氧化酶可以将儿茶素氧化成邻醌，然后进一步氧化聚合形成茶黄素。茶黄素（Theaflavins，TFs）是一种水溶性色素物质，是形成红茶品质的重要物质。此外，TFs 还具有较强的抗氧化和清除自由基等功能，对人类健康和临床医疗具有重要作用和药用价值。 茶树ppo是体外酶促氧化合成茶黄素的关键酶。随着分子生物学的发展，人们已经成功克隆出茶树多酚氧化酶的基因（Raizada J等）。茶树PPO是核基因编码的铜离子结合酶，PPO存在于质体中，它在细胞质中合成，大多数经过加工，最后运输到叶绿体，形成有活性的酶。成熟的茶树PPO基因全长1.8kb左右，没有内含子（赵东等，2001）。PPO 酶源问题一直是体外酶促氧化合成茶黄素的关键性因素。随着分子生物学的发展，人们已经成功克隆出茶多酚氧化酶的基因，不仅如此，近年来各种优化的融合蛋白表达系统也相继出现。通过基因表达的方式获取高纯度的多酚氧化酶是一种获得酶源的新方法。它的优势主要在于能够提高目的蛋白的表达效率，控制蛋白表达方式，并可以对目的蛋白加以标示和跟踪，而且也便于目的蛋白的纯化。有研究者通过构建茶多酚氧化酶基因的原核表达载体对其进行了原核诱导表达（Liu J. W等,2010）,在原核表达过程中，目的蛋白容易形成包涵体，需要进行蛋白复性处理。然而，蛋白复性相对比较复杂，且在一定程度上会影响蛋白的活性（Scorer C. A等，1994），这并不符合工业化大量获取活性PPO的要求。 相对于原核表达系统，酵母表达系统不仅具备细菌表达系统生长周期短、产量高、易培养等优点，同时它还具有真核生物所独有的翻译后修饰能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰（杨梅等，2011），且在密码子偏好性上更加贴近真核生物，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质（吴贻良，2009）。 本课题选用国家级茶树良种迎霜为材料,以鲜叶基因组DNA为模板,克隆茶树PPO基因,并进行真核表达,以获得具有生物活性的茶树PPO工程蛋白酶,为应用于红茶加工以及茶黄素的生产等方面提供实验基础。 参考文献目录[1] 宛晓春. 茶树生物化学[M]. 北京:中国农业出版社, 2003: 30-31. [2]赵东，刘兀生，奚彪，茶树多酚氧化酶基因的克隆及其序列比较.茶叶科学，2001，21（2）:94-98. [3]Liu J. W, Huang Y. Y, Ding J, Liu C, Xiao X. D, Ni D. J. Prokaryotic Expression and Purification of Camellia Sinensis Polyphenol Oxidase. J Sci Food Agric, 2010, 90(14): 2490-2494. [4]Scorer C. A, Clare J. J, Mccombie W. R, Romanos M. A, Sreekrishna K. Rapid Selection using G418 of High Copy Number Transformants of Pichia Pastoris for High-Le