牛传染性鼻气管炎和赤羽病分子检测方法的建立和应用.pdfVIP

牛传染性鼻气管炎和赤羽病分子检测方法的建立和应用 摘 要 牛传染性鼻气管炎（IBR）和赤羽病（AKA）是两种重要的危害养牛业的病毒性传染疾 病，曾给养牛业带来巨大的经济损失，我国进出口境牛及其相关产品大多要求对这两种疫 病进行检疫。目前检测 IBR 和 AKA 的方法主要有免疫荧光抗体试验、中和试验、酶联免疫 吸附试验、电镜技术和胶体金等技术，这些方法对检测 IBRV 和 AKAV 起到了重要作用，但 同时也存在特异性不强、灵敏性差、耗时长等缺点。迫切需要建立早期的快速、准确的牛 病诊断方法，以预防和清除该类传染病隐性感染，确实保护我国畜牧业的健康快速发展。 本研究成功建立了检测牛传染性鼻气管炎（IBR）和赤羽病（AKA）的快速检测体系，包括 多重 PCR、基因芯片和荧光定量 PCR 法，并优化了一系列反应条件，建立了相应的检测试 剂盒，大大加快了牛传染性鼻气管炎（IBR）和赤羽病（AKA）的检测速度并提高了灵敏度。 现将所做工作介绍总结如下： (1)双重 PCR 检测体系。根据牛疱疹病毒 1 型(BHV1)gB基因序列和赤羽病病毒 (AKAV) 的 S 基因序列,设计了 2 对针对这 2 种病毒的特异引物，成功构建了包含扩增片段的阳性 标准质粒。建立和优化了 2 种病毒的多重 PCR 检测体系，经优化后确定退火温度 Tm 值为 2+ 59℃，Mg 浓度为 1.5 nmol/µL。双重PCR 阳性标准质粒检测灵敏度 IBRV 的灵敏度为 0.13 pg/25µL，AKAV 的灵敏度为 1.04 pg/25µL。 (2)基因芯片检测方法。在双重 PCR 的基础上，在所扩增片段中设计特异性、保守性 的寡核苷酸探针，扩增产物时，用荧光素Cy3 标记正向引物的 5′端。实验确定了适宜杂 交温度为 38 ℃。基因芯片检测阳性标准质粒 IBRV 的灵敏度为 0.013 pg/25µL，AKAV 的灵 敏度为 0.104 pg/25µL。 (3)荧光定量 PCR 法。在所构建的两种病毒的阳性标准质粒基础上，分别设计 2 对特 异性引物，通过对荧光定量 PCR 反应条件的优化,建立了 SYBR Green I 荧光定量 PCR 分别 检测 IBRV 和 AKAV 的方法。检测 IBRV 阳性标准质粒的灵敏度为 1.3 fg （相当于360copies） /25µL,AKAV 阳性标准质粒的灵敏度为 1.04 fg （相当于926copies）/25µL。 上述三种检测方法中，多重 PCR 方法灵敏度最低，基因芯片方法次之，荧光定量方法 最高。多重 PCR 操作相对简单，而且仪器便宜，基因芯片方法操作最复杂，仪器昂贵，其 高通量优势比较明显。荧光定量 PCR 方法虽然相对较好，但不能同时检测两种病毒。所以 三种方法各有优缺点，需根据不同情况选择使用。 关键词：IBRV，AKAV，多重PCR，基因芯片，荧光定量PCR. I Establishment and primary application molecular detection methods for Infectious bovine rhinotracheitis and Akabane disease Abstract Infectious bovine rhinotracheitis (IBR) and Akabane disease are two important harmful viral transmitted diseases in cattle industry.Import-export cattle and their products should be performed quarantine for these two diseases . The main detection methods to IBRV and AKAV include immunofluorescent antibody test ,Neutralization test ,En