蛋白质表达和抗体制备.ppt

在基因克隆的研究工作中，人们的主要兴趣往往不在目的基因本身，而是其编码的蛋白质产物，特别是那些商业上、医疗上以及科研工作中具有重要意义的蛋白质。最为快速简便的方法就是将这些蛋白质的基因克隆到特定表达载体上。使其高效率的表达。 * 各种表达系统由于翻译后的加工不完全相同，因而产生的重组蛋白的生物学活性和免疫原性有时会有差别。因此，选择表达系统时，必须充分考虑各种因素，如所需要表达的蛋白是否有毒性，是否有活性，是否需要糖基化，还需要考虑成本、产量及纯化路线和安全性。 对于我们来说，最常用和最需掌握的是大肠杆菌表达系统 * 一个蛋白要成功的在E.coli系统表达，就是要根据表达目的在载体，菌株和培养条件三个主要因素之间找到一个理想的结合点。以达到⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。 * * 如果目的蛋白用于分析级的活性分析、筛选与配体相互作用的蛋白质、制备抗原时，通常与一些融合标签进行融合表达。这些融合标签使得目的蛋白易于分离和纯化，并且有利于增加蛋白质的稳定性。如His、GST、Flag、MBP、还有一些荧光蛋白。 外源蛋白在大肠杆菌中能够高效表达，主要取决于好的表达载体，好的表达载体一般采用强的启动子和终止子，以及合适的SD（核糖体结合）序列，其中最关键的是启动子，目前常用的大肠杆菌表达系统常用Lac、Trp、Tac、T7、PL或P8等