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金霉素生物合成基因ctcK探究 　　摘要为检测ctcK基因的功能，利用基因工程技术在金色链霉菌J13（Streptomyces aureofaciens J13）上构建ctcK基因缺失工程菌SK12（ΔctcK），并分析了其次级代谢产物的变化.经质谱分析显示，工程菌SK12代谢物中检测到去甲基金霉素m/z=465.10 [M+H]+的分子离子峰，但未检测到金霉素m/z=479.12 [M+H]+的分子离子峰，这与出发菌J13代谢物的检测结果相反.结果表明，ctcK基因的失活阻断了金霉素的生物合成代谢流，使工程菌SK12主要积累去甲基金霉素，显示ctcK基因参与金霉素C6位甲基化.本研究初步阐明了ctcK基因的功能，同时获得了一株主产去甲基金霉素的工程菌. 关键词ctcK基因；去甲基金霉素；甲基化；生物合成；金色链霉菌 中图分类号Q935文献标识码A文章编2017 金霉素（CTC）是一?临床上主要用于治疗革兰氏阳性球菌，特别是葡萄球菌（Staphylococcus）、肺炎球菌（Streptococus pneumoniae）的四环类广谱抗生素.除了抗生和抗炎功效之外[13]，自20世纪80年代以来，科学家还陆续发现金霉素具有抗肿瘤活性[4]、非抗菌作用[5]及非抗感染用途[6].去甲基金霉素（DMCTC），亦属于四环类抗生素，与金霉素相比在C6位少了一个甲基.去甲基金霉素不仅对革兰氏阳性和阴性菌有抑菌活性，对衣原体（Chlamydia）、立克次体（Rickettsia）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia）等致病性病毒亦有很好的抑制效果.与金霉素相比，去甲基金霉素不仅抗菌活力更强、结构更稳定、还因具有易被人体吸收、排泄快、长效性和高效性等优点而被广泛应用.此外，它还是合成米诺环素和替加环素的重要母体[7]. 金霉素生物合成途径和生物合成基因的相关研究不多[810].2013年，邓子新团队报道了金霉素生物合成基因簇并确定了卤化酶基因，同时还推测ctcK基因可能是金霉素C6位甲基化酶基因，但至今仍未经生物学实验证明（GenBank：HM627755）[11].基于本实验室已建立的大肠杆菌（Escherichia coli）与金色链霉菌接合转移体系[1213]，本研究采用基因框内敲除方法，特异性灭活ctcK基因，分析ctcK基因失活突变株代谢产物的变化，旨在阐明ctcK基因在金霉素pretetramid到6methylpretetramid生物转化中的作用，进而验证ctcK基因是否为金霉素C6位甲基化酶基因.研究结果可间接获得主产去甲基金霉素的工程菌，为开发去甲基金霉素等系列药物奠定基础. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株与质粒金色链霉菌J13，大肠杆菌top10，大肠杆菌ET12567（pUZ8002），大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pKC1139及pJTU412均为本实验室保藏；克隆载体pMD19T购自TaKaRa公司. 1.1.2培养基与抗生素金色链霉菌斜面培养基及预萌发培养基见文献[13]，种子培养基及发酵培养基见文献[14]；大肠杆菌生长培养基为LB培养基[15].本研究中使用的抗生素及其终浓度分别为：氨苄青霉素 100 mg/L，安普霉素 50 mg/L，氯霉素 25 mg/L，卡那霉素 50 mg/L，萘啶酮酸 25 mg/L. 1.1.3主要试剂限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司；溶菌酶，RNase A酶，Proteinase K和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工公司；其他常规试剂见文献[16]. 1.2方法 1.2.1引物设计以金霉素生物合成基因簇（GenBank：HM627755）为模板，设计两对引物K1/K2和K3/K4，分别用于扩增ctcK基因上游交换臂KB1和下游交换臂KB2；再根据同源重组原理，设计两对筛选单交换和双交换的鉴定引物K5/K6和K7/K8；引物序列及其限制酶见表1. 1.2.2分子克隆PCR、酶切、酶连、大肠杆菌感受态细胞制备及其转化、小量质粒DNA提取，方法参见实验手册[17]；金色链霉菌染色体DNA提取参见链霉菌遗传操作手册[16]；DNA测序委托上海生工公司. 1.2.3单交换突变株筛选将重组质粒转化大肠杆菌ET12567（pUZ8002），再通过接合转移方法将其导入金色链霉菌J13. 35 ℃培养16～20 h后，覆盖30 mg/L安普霉素和25 mg/L萘啶酮酸，继续在35 ℃培养，4 d后长出接合子.挑取其中一株命名为金色链霉菌SK11，简称SK11，提取其基因组DNA作为模板，进行PCR验证.接合转移具体