第一章 基因工程的主要技术原理.ppt

但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 （4）模板（template) ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 （5）dNTPs 一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。 （6）Mg 2+ 的浓度 所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。 借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 6. PCR技术的扩展 （1）荧光实时定量PCR Real—time? PCR（或TaqMan? PCR ） Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。 扩增两个引物外侧的未知序列 （2）反向PCR 把线性DNA模板转变成环形分子。 template template 3’ 5’ 5’ 3’ （传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。 技术关键： 使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。 低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。 （3）不对称PCR 3’ 5’ 5’ 3’ 引物少 用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。 技术关键： 两个引物的浓度相差100倍。 扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。 （4）反转录PCR（RT-PCR) Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖 技术关键： 利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 RNA template 3’ 5’ 下游引物 cDNA first strand 3’ 5’ 上游引物 cDNA first strand cDNA second strand 3’ 5’ 3’ 5’ 反转录酶 Taq酶 PCR Reverse transcription (RT) 下游引物 上游引物 Taq酶 7. PCR技术的应用 （1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列； 在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。 （2）基因的体外诱变 技术关键： 利用引物的5‘端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。 设计引物定点诱变 利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。 （3）基因组的比较研究 比较不同物种之间的基因组特征和相似性。 类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。 RAPD (Random amplified polymorphism DNA) 1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题： 当时没有能把不同长度的核苷酸片断分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。 第五节 DNA序列分析 （1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片断法）。 5 Sanger等1977年发明。 一、双脱氧链终止法 Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。 （2）DNA模板与引物复性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（primer）: 40-65oC DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。 （3）DNA链的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。 变性—复性—延伸。 （5）1个循环的结果 （4）新一轮循环开始 DN