三种山羊全血基因组DNA提取方法的比较.docVIP

三种山羊全血基因组DNA提取方法的比较 DNA提取是分子生物学研究中的一个关键环节，全血是常用于DNA提取的实验材料，有酚／氯仿提取法、碘化钠法及尿素提取等作为DNA提取的方法，但都存在不足之处。 碘化钾法提取DNA 1)取ACD抗凝血样300uL，加入到1.5 mL Ep—pendorf管中，再加入1 000uL的0.9％NaCl溶液，旋涡振荡30s，12000 r/min 离心5min，弃上清。 2)沉淀中加入血样300uL，然后加入900uL的0．9％NaCI溶液，旋涡振荡30 S，12 000 r/min离心,5min，弃上清。 3)沉淀中加入100 uL的5 mol/L碘化钾溶液，漩涡振荡30 s。加入300uL 0.9％NaCI溶液和400uL的氯仿／异醇(24：1)，旋涡振荡30 s，12 000 r／min离心5min。取上清至新1.5 mL Eppendor管。 4)加入异丙醇120uL轻轻混匀，12000 r/min离心5 min，弃上清；再加入提前冷却的无水乙醇1000uL，12000 r/min 离心5min，弃上清。 5)沉淀用-20℃预冷1000ul的70％乙醇洗涤，12000 r/min离心1 min，弃上清；将离心管倒立于滤纸上风干；加80ul。TE溶解后，在4℃条件下过夜，使DNA水合，-20℃保存备用。 酚／氯仿法 1)取ACD抗凝血样400uL于1.5 mL Eppen—dorf管中，再加入100uL红细胞裂解液(10mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCI，5mmol/L MgCl2)，旋涡振荡30 s，室温放置10min，12000r/min离心30 s，弃上清。 2)加120uL红细胞裂解液，旋涡振荡30s，室温放置5min，10000 r/min离心30 s，弃上清。 3)沉淀中加30uL红细胞裂解液，旋涡振荡30s，加白细胞裂解液(5 mmol/L NaCI，lOmmol/LEDTA，10mmol/LTris—HCl)300uL，10％十二烷基硫酸钠(SDS)8uL，蛋白酶K20uL(20mg/mL)，56C水浴消化3h，得到清亮粘稠液体。 4)加400uL酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)混匀，室温放置10 min，12 000 r/min离心15min。取上清至新1.5mL Eppendorf管。 5)加等体积氯仿混匀，室温放置10min，12 000r/min离心15 min。取上清至新1.5 mL Eppendorf 管。 6)加1/lO体积3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)，2倍体积预冷无水乙醇，混匀，冰浴2～3 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清。 7)沉淀用20℃预冷1 000uL的70％乙醇洗涤，12 000 r/min离心1 min，弃上清；将离心管倒立于滤纸上风干；加50uL TE溶解，在4℃条件下过夜，使DNA水合，一20℃保存备用。 DNA浓度、纯度和完整性检测 用NanoDrop ND-1000微型分光光度计(NanoDrop，USA)检测DNA产量和纯度，结果用平均数士标准误表示。用0．7％琼脂糖凝胶电泳检验基因组DNA的完整性。 PCR扩增及检测 为检查碘化钾法提取的基因组DNA质量，进行PCR扩增试验,扩增位点山羊生长激素基因部分序列。引物序列为，F：5‘GGAC-CCAGTTCACCAGACG-3 ’， R： 5’-TCGCAT-TCAGAAGCCCTA-3’，由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR反应总体积为25.0uL，包括10umol／L的上、下游引物混合液1.0uL，HotstartTaq MasterMix(TIANGEN)10uL，DNA模板1.0uL，去离子水13uL。反应程序为：预变性95℃ 5min；95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，33个循环；最后72℃继续延伸8 min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。 碘化钾法可望成为提取山羊全血基因组DNA的理想方法。