全血RNA提取.docVIP

Qtiangen的RNAprep pure 血液总RNA提取试剂盒 本试剂盒可从血液中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。提取的总RNA 纯度高，没有蛋白和其它杂质的污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析分子克隆等多种下游实验。?操作步骤：1. 红细胞裂解液的稀释：根据处理血液样品的体积选取适当体积的10×红细胞裂解液（例如待处理的血液样品体积为200 μl，则取140 μl 10×红细胞裂解液），用RNase-free ddH2O 稀释至1×红细胞裂解液。2. 向1 体积人类全血中加5 倍体积1×红细胞裂解液(需自备合适的干净管子)。注意：为获得最佳的混匀效果，血液和1×红细胞裂解液的混合液体积不应超过管子体积的3/4。如果血液中的白细胞含量较高，可按比例减小血液的使用体积，第6 步中的裂解液RL的使用体积也要进行相应调整。3. 在冰上孵育10-15 分钟，在孵育过程中涡旋振荡混匀2 次。注意：在孵育的过程中溶液将变成半透明状态，表明红细胞裂解。如果必要的话，孵育时间可延长至20 分钟。4. 4℃ 2,100rpm (~400×g)离心10 分钟，将上清完全去除。注意：离心后白细胞可能会形成小球，确保完全去除上清，痕量红细胞的存在，会使白细胞小球呈现红色，而该现象会在随后的漂洗步骤中消失。5. 向白细胞沉淀中加入1×红细胞裂解液（加入1×红细胞裂解液的体积是第1 步中全血用量的2 倍），重悬细胞。6. 4℃，2,100rpm (~400×g)离心10 分钟，将上清完全去除。注意：如果上清去除不完全将会影响裂解及随后的RNA 与膜的结合，导致最后RNA产率降低。7. 向白细胞沉淀中加入裂解液RL（使用前请加入β-巯基乙醇），具体加量按照下表进行，涡旋或使用移液器混匀。注：如果血液不是健康人的全血，需要根据血液中白细胞的数量来确定所需裂解液RL的体积，此时细胞应完全裂解，块状细胞沉淀消失。8. 将溶液转移至过滤柱CS 中（过滤柱CS 放在收集管中），12,000 rpm (~13,400×g )离心2 分钟，弃去过滤柱CS，收集滤液。注意：为避免气溶胶的形成，请将移液器调整到≥750μl以保证一次性将所有溶液转移到过滤柱上，如果细胞太多，将会出现裂解液粘稠的现象，造成难以吸取的情况。9. 向滤液中加入1 倍体积70%乙醇（通常为350μl 或600μl），混匀（此时可能会出现沉淀），得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR2 中（吸附柱CR2 放入收集管中），12,000 rpm(~13,400×g )离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。注意：配制70%乙醇时请使用RNase-free ddH2O，如果滤液体积有所损失，请相应减少70%乙醇用量。将溶液和沉淀转移至吸附柱CR2 时，体积大于吸附柱容量，可以分两次完成。10. 向吸附柱CR2 中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。11. DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 储存液放入新的RNase-free 离心管中，加入70 μl RDD 溶液，轻柔混匀。12. 向吸附柱CR2 中央加入80 μl 的DNase I 工作液，室温放置15 分钟。13. 向吸附柱CR2 中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。14. 向吸附柱CR2 中加入500 μl漂洗液RW （使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2 分钟，12,000 rpm(~13,400×g)离心30-60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR2 放回收集管中。15. 重复步骤14。16. 12,000 rpm(~13,400×g)离心2 分钟，倒掉废液。将吸附柱CR2 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，离心后将吸附柱CR2 在室温放置片刻，以充分晾干。如果有漂洗液残留，可能会影响后续的RT等实验。17. 将吸附柱CR2 转入一个新的RNase-free 离心管中，加入30-50 μl RNase-freeddH2O 室温放置2 分钟，12,000 rpm(~13,400×g)离心2 分钟，得到RNA 溶液。注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70