基层中心血站如何正确手工操作ELISA测定.pdf

孔深，原因为96孔板周孔与中心孔表面热力学梯度不同。使 长450nm)为底物和以0PD(比色波长492nm)为底物的试剂 用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热 盒均有使用，滤光片需根据要求随时更换。故易出现滤光片 至温育温度(如37℃)，就可排除“边缘效应”，且可提高测定错用的问题。2)单波长或双波长比色选择的问题。单波长比 重复性。 色以对显色具有最大吸收的波长如450lml或492nm进行比 总而言之，尽量采用水浴，温育中让微孔板浮于水面上， 色测定；而双波长比色则在敏感波长450眦和非敏感波长 630 或将浸透水的沙布放入一大饭盒中成一湿盒，放于温箱中。 nm各测定1次。敏感波上下的吸光度测定值为样本测 这样因板条孔底部直接与37℃水或湿布的接触，水浴箱或湿 定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物 盒内的高温度使反应溶液的温度迅速与温室平衡。 所致的吸光度之和。非敏感波长下测定即改变波长至一定 5 ELISA测定的洗板 值，使得样本测定酶反应特异显色的吸光度值为零，此时测得 洗板对于ELlSA测定是极其关键的一步。以HRP作为的为脏物的吸光度值。最后酶标仪给出的数值为敏感波长与 标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含o．05％非敏感波长下的吸光度值的差。如在使用双波长比色时，仍 Tween20的中性PBS。Tween20为一种非离子去垢剂。既含设空白孔，就可能会造成前面提到的测定孔吸光度为负数的 亲水基团，也含疏水基团。由于抗体或抗原的包被通常也是 现象。由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一 通过在碱性条件下与固相的疏水性相互作用而被动吸附于固 定程度的不确定性，故而在EI，ISA测定比色时最好使用双波 长比色。 相，因此要注意非离子去垢剂的使用浓度，洗板液中Tween20 浓度高于O．2％，可使包被于固相上的抗原或抗体解吸附而 8 ELISA测定结果判定 影响试验的测定下限。 临床ELISA测定结果分为定量和定性两大类。1)定量 ELISA测定的洗板有两种方式：1)手工洗板是在每次反测定则是对标本中待测抗原的多少进行量值测定，以具体数 应温育后，将反应液吸出或甩干，然后在板孔中加满洗液，放 值表示。它是用于非病原体抗原物质的测定，如激素、细胞因 置2～3分钟后，将洗液吸出或甩干，再在吸水纸上拍干。重 子、肿瘤标志物、小分子药物等。定量测定的“量值”依据是试 复上述洗涤步骤3～4次，最后在吸水纸上拍干，即可进行下 剂盒中所带标准品同时测定得出的剂量反应曲线(又称标准 一步测定操作。2)洗板机洗板则是将上述手工操作改由洗板 曲线)。2)定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体 机进行，但每次洗板后不能拍干。故有较多的液体残留。使用 作出“有”或“无”的结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示。通 洗板机到底洗多少次能达到要求，可进行下面这个简单的实 常是用于传染性病原体的抗原或抗体的测定，以判断特定病 验：选择4×8HBsAgELISA包被板条，每2×8孔分别加入原体感染的存在与否。定性测定的“阳性”和“阳性”的判定 相同一份弱阳性和一份阴性样本。按试剂盒说明加入酶结合 依据必须是试剂盒所确定的阳性判定值(Cut—off)。以前很 物并完成温育。洗板均为4孔时，按第1排洗1次、第2排洗多基层实验室均使用卫生部临床检验中心供应的弱阳性定值 2次、第3排洗3次一直至第8排洗8次。加底物显色测定，质控血清(以前也称“临界值”血清)的测定吸光度来判定结 如洗3次后，显色不再改变，即洗3次的板孔比色测定与4 果，高于其判为阳性，反之为阴性，而不管试剂盒Cut—off值 次、5次洗板的板孔的吸光度相同，阳性／阴性值保持最大不 如何。至今仍有一些实验室在坚持这种错误的做法应予纠 变，则可认定所用洗板机3次洗板即可达到要求一]。 正。 6以0PD和TMB为底物的显色 9 EI．ISA结果报告及