生物化学简明教程第十三章DNA的生物合成.ppt

‖‖‖ * * 化学因素 突变的分子改变类型： 错配、缺失、插入 、重排 （1）错配：DNA分子上的碱基错配称点突变。 转换：发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 颠换：发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 （2）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。 缺失或插入都可导致框移突变 。 框移突变：指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 谷 酪 蛋 丝 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 正常 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 缺失C （3）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。 由基因重排引起的两种地中海贫血基因型 13.5.2 DNA损伤的修复 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态 修复的主要类型 光修复（light repairing） 切除修复（excision repairing） 重组修复（recombination repairing） SOS修复 直接修复： 如光复活酶,可以把嘧啶二聚体恢复正常状态。 切除修复： 找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。 重组修复： 先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤 处留下缺口，先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口。 SOS系统： 复杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。 （a）DNA糖基化酶切除损伤的碱基产生无碱基酸 （b）无碱基核酸内切酶在无碱基酸处切开产生切口。 （c）DNA聚合酶Ⅰ将无碱基酸切除并填补缺口。 （d）DNA连接酶连接切口。 13.6 DNA的重组与克隆 DNA的重组 高等生物在细胞减数分裂时，同源染色体之间可以进行DNA片段的交换，病毒、噬菌体或质粒DNA插入（整合到）宿主的染色体 DNA的克隆 就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝” 13.6.1 DNA的重组 同源重组 发生在同源序列之间、非特异性重组 交换区具有相同或相似的序列 两个DNA分子相同的部位、不同部位（异位重组） 位点特异性重组 可以将两个短的DNA特定序列（即特异位点）之间的基因从染色体上切除或组合到染色体另一个特定位点 13.6.2 DNA的克隆 在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的载体, 形成重组的DNA分子, 并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合，获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning），即无性繁殖。 PCR（聚合酶链式反应） 概念：一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。 原理：DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 应用：遗传病和疑难病的诊断、孕妇的产前检查、病原体检查、法医和刑侦鉴定、基因探针的制备、基因组测序、染色体步查、cDNA库的构建、基因的定点诱变、基因突变的分析、基因的分离和克隆等 基因克隆的基本条件 工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等 目的基因：cDNA或基因组DNA 载体：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等 宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞 限制性核酸内切酶 存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。 常用的是II类限制性内切酶，许多限制性核酸内切酶II的识别序列为回文结构 配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端 DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段 （Klenow 酶）、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等 DNA连接酶 T4