低剂量ALA―PDT对人角质形成细胞生长及分泌细胞因子作用探究.docVIP

低剂量ALA―PDT对人角质形成细胞生长及分泌细胞因子作用探究 　　[摘要]目的：研究不同剂量5-氨基酮戊酸-光动力治疗（5-aminolevulinic acid photodynami c，ALA-PDT）对体外培养的人角质形成细胞增殖的影响和分泌生长因子的作用。方法：首先以噻唑蓝（methylthi azolyldiphenyl-tetrazo liumbromide，MTT）检测ALA-PDT对永生化人角质形成细胞（HaCaT细胞系）增殖的影响，再用相同的方法检测ALA-PDT对分离的人角质形成细胞（kerot inocyte，Kc）增殖的影响，最后vXELISA法检测ALA-PDT对Kc培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量的影响。结果：低剂量ALA-PDT（0.1mM和0.OlmM ALA，红光21J/cm2）能促进HaCaT细胞和人角质形成细胞的增殖；高剂量ALA-PDT（0.5mM ALA，红光21J/cm2）抑制其增殖。低剂量ALA-PDT干预24h后，bFGF分泌明显高于0.5mM ALA组和单纯红光组；而VEGF呈现24h时轻度下降，24h后明显增加的趋势。结论：高剂量ALA-PDT抑制角质形成细胞的增殖，甚至杀伤细胞；低剂量ALA-PDT能促进角质形成细胞的增殖，并且促进角质形成细胞分泌bFGF和VEGF [关键词]HaCaT细胞；角质形成细胞；光动力治疗；ALA-PDT；碱性成纤维细胞生长因子；血管内皮生长因子 [中图分类号]R339.38 Q813.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-645 5（2017）01-0013-03 光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）指的是在光敏剂参与下，以特定波长的光照射病灶区，产生氧化还原反应，生成各种高反应性的化学活性物质，达到治疗目的的新型治疗方法。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）是目前光动力局部治疗中最常用的光敏剂之一。应用PDT治疗疾病过程中，研究者们发现高剂量PDT可以杀灭肿瘤细胞和微生物，低剂量的则有抑制炎症，治疗光老化等作用。为了进一步了解低剂量光动力对人角质形成细胞的作用，本文拟研究不同剂量ALA-PDT对人角质形成细胞（kerotinocyte，Kc）增殖的影响和分泌细胞因子的作用 1.材料和方法 1.1主要材料：改良1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司）、小牛血清（gibco，新西兰）、二甲基亚砜（DMSO，成都市科龙化工试剂厂）、Epilife培养基（gibco，Cascade Biologics）、磷酸缓冲盐溶液（PBS，北京中杉金桥）、分离酶（Roche，日本）、胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT，重庆索莱宝）、5氨基酮戊酸（北京英发康美）、ELISA试剂盒（上海依科赛生物制品有限公司）；LED IA光动力治疗仪（武汉亚格光技术有限公司） 1.2HaCaT细胞的分离培养和传代：HaCaT细胞系来源于上海中科院细胞研究所，由本实验室冻存传代。用常规方法复苏细胞后，使用含5%小牛血清的改良1640培养基在37°C二氧化碳培养箱常规培养。细胞增殖至铺满80%左右时，使用胰蛋白酶常温下消化数分钟，小牛血清终止消化，常规方法传代 1.3Kc的分离培养和传代：皮肤来源于正常男子包皮环切术后包皮组织。取全层皮肤用PBS反复漂洗后，除去脂肪和结缔组织。剪碎皮肤移入分离酶中，4°C过夜后分离表皮，热消化，1000rpm离心5min，加入Epilife培养基常规培养。细胞增殖至铺满80%左右时，使用胰蛋白酶冷消化，常规方法传代 1.4实验分组与实验方法 1.4.1HaCaT细胞MTT实验：接种HaCaT细胞于3块24孔板，细胞密度40000个/孔，每块板均设4个组，A（ALAOmM，红光能量21J/cm2），B（ALA 0.01mM，红光能量21J/cm2），c（ALA0.1mM，红光能量21J/cm2），D（ALA0.5mM，?t光能量21J/cm2）。各组培养24h后，按分组加入ALA避光孵育30min，633nm红光照射，分别于0h、24h、48行MTT测A490值 1.4.2人角质形成细胞MTT实验：接种角质形成细胞于3块96孔板，细胞密度104个/孔，分组和实验均同HaCaT细胞，最后也分别于0h、2411、48h行MTT测A490值 1.4.3细胞因子ELISA检测：实验分组同人角质形成细胞MTT实验，每组培养24h，加入ALA避光孵育30mi