气相色谱燃烧同位素比值质谱法探析氨基酸氮稳定同位素并初步评估水生生物体营养级.doc

气相色谱燃烧同位素比值质谱法探析氨基酸氮稳定同位素并初步评估水生生物体营养级 　　摘要氨基酸稳定氮同位素（δ15N）分析能准确有效地评估生物体的营养级以及氮在食物链中的流动。本研究优化了氨基酸氮同位素的分析方法：样品在酸性条件下水解后， 释放出的蛋白质氨基酸经阳离子交换树脂纯化后， 衍生为对应的N新戊酰基， O异丙醇（Npivaloylisopropyl， NPP）酯， 利用气相色谱燃烧同位素比值质谱仪（Gas chromatographycombustionisotope ratio mass spectrometry， GCCIRMS）测定其δ15N。经非极性气相色谱柱DB5ms分离后， 13种氨基酸NPP酯衍生物均可得到良好的基线分离。在样品量不低于20 ng N条件下， GCCIRMS方法的精密度优于1‰， 测得的δ15N值与EAIRMS法测得的δ15N值没有明显差异。阳离子树脂纯化前后各氨基酸δ15N值差异低于1‰， 表明没有产生明显的同位素分馏。采用本方法成功地估算了阿哈湖生态系统中常见水生生物的营养级， 可作为研究氨基酸代谢以及生态系统特征的新方法 关键词N新戊酰基，O异丙醇（NPP）酯； 氨基酸； 气相色谱燃烧同位素比值质谱； 营养级 1引 言 氮稳定同位素已广泛用来研究生态系统的特征与过程[1]。其中， 生物体有机质总氮同位素的组成（δ15N）已成为一系列生态学研究的重要手段之一， 尤其是用于评估有机体的营养级和测定氮在食物链中的流动[2]。总氮同位素方法用来评估营养级是基于大量研究的平均观测值：δ15N随食物网的富集指示大约为3.4‰[3]。然而总氮同位素方法也有局限性：（1）不同物种间的δ15N富集程度存在明显差异。DeNiro 和Epstein研究发现， 不同纲属动物（昆虫纲， 哺乳纲等）的 N值会造成所研究生态系统中营养关系的严重误判 氨基酸单体氮同位素组成是可以准确有效地估算有机体营养级。研究表明， 生物体内谷氨酸（Glu）以及苯丙氨酸（Phe）氮同位素比值差异可以指示其营养级[5～7]。代谢过程中， 谷氨酸快速进行转氨基作用， CN键断裂， δ15N富集较大（+8.0‰）。相反， 苯丙氨酸的主要代谢步骤是增加一个羟基基团转化成酪氨酸， 此过程不伴随CN键断裂， δ15N富集不明显（+0.4‰）， 这种代谢关系的差异导致在特定营养级的有机体中谷氨酸和苯丙氨酸的δ15N明显不同。水生生态系统有机体营养级计算公式为[8，9]： TLGlu/Phe =1+ （δ15NGlu-δ15NPhe-3.4）/7.6（1） 在文献[10]基础上， 本研究对GC条件、前处理方法以及衍生技术进行了优化。本方法准确性高， 重现性好， 为分析氨基酸氮稳定同位素以及评估水生生物体营养级提供参考 2实验部分 2.1仪器与试剂 气相色谱燃烧同位素比值质谱仪（GCCIRMS， 美国ThermoFisher公司）； 气相色谱质谱仪（GCMS， 689070000C， 美国Agilent公司）；元素分析仪（EA， 美国ThermoFisher公司）； 氮吹仪（BYN1002， 上海秉越电子仪器有限公司） 13种氨基酸标准品：丙氨酸， 甘氨酸， 缬氨酸， 亮氨酸， 异亮氨酸， 脯氨酸， 天冬氨酸， 蛋氨酸， 丝氨酸， 苏氨酸， 谷氨酸和苯丙氨酸和γ氨基丁酸， 以及内标氨基酸：正亮氨酸和β氨基丁酸的纯度均为99.9%， 均购于美国SigmaAldrich公司。阳离子交换树脂（Dowex 50W X8 H+， 200～400 mesh， SigmaAldrich公司）用于纯化样品。水解和衍生试剂包括： 12.1 mol/L HCl（ACS级）、 甲醇（色谱级）、 正己烷、 二氯甲烷、 亚硫酰氯、 新戊酰氯、 无水MgSO4， 均购于上海阿拉丁公司 2.2实验方法 2.2.1生物样品采集、氨基酸提取以及衍生化 本研究的样品为2015年8月10日自阿哈湖水域（东经106°39′， 北纬26°33′）随机采集9种水生生物。所有样品冷冻干燥后， 研磨均匀。准确称取10 mg样品置于反应瓶中， 加入0.5 mL 2.1mol/L HCl后密封， 于110℃下水解24 h。室温冷却后， 水解液在60℃下用氮气吹干。水解产物溶解于0.1 mol/L HCl， 经正己烷二氯甲烷（3∶2， V/V）充分脱脂后，过阳离子交换树脂纯化， 用4 mol/L 氨水洗脱。内标加入洗脱液中， 经氮吹仪吹干， 并按照上述方法进行衍生化。阳离子交换树脂处理后可能存在的背景干扰由相应的空白程序检验 2.2.2生物样品氨基酸混标衍生化标准样品溶液充分干燥后加入1 mL亚硫酰氯异丙醇（1∶4， V/V）于11