可诱导共刺激分子转基因小鼠模型的建立.pdfVIP

华东地区第十届实验动物科学学术交流会 325 可诱导共刺激分子转基因小鼠模型的建立 濮翔科-，2，薛智谋z，岳挺，，陈敏，，杭双熊I王永忠1 (1．常州市第三人民医院临床实验室，常州213001；2．苏州大学实验动物中心i苏州215123； 3．扬州大学比较医学中心，扬州225009) 【摘要]目的建立可诱导共刺激分子转基因小鼠模型。方法采用RT．PCR方法从活化的人扁桃 体T淋巴细胞中克隆可诱导共刺激分子(ICOS)eDNA，通过显微注射和胚胎移植建立转基因小鼠， 共注射移植胚胎117枚，移植后出生小鼠43只，抽提鼠尾组织DNA经过PCR检测得到两只阳性 小鼠．再经Southern检测证明外源基因已经整合进小鼠基因组。将转基因小鼠繁殖扩群，观测转 基因小鼠生长繁殖特性，绘制小鼠生长曲线。结果ICOS基因能够在小鼠基因组中稳定整合与遗 传，转基因小鼠的生长繁殖性能与野生型小鼠没有明显差异。结论ICOS转基因小鼠模型已经成 功建立，为进一步培育转基因小鼠品系，以转基因小鼠模型为工具研究ICOS基因功能奠定了基础。 [关键词】可诱导共刺激分子(ICOS)；转基因；遗传 T细胞的活化，不仅要获得第一信号即抗原特异性信号，还必须获得它与抗原呈递细胞表达的膜分 子相互作用后产生的第二信号即共刺激信号。若仅有第一信号，T细胞将进入无反应状态或免疫耐受状 态，甚至进入程序性死亡【l】。共刺激信号对调节T细胞生长、分化和细胞因子的产生具有重要作用。对 共刺激分子的深入研究，可以加深对机体免疫调节机制的认识，从而为临床医学提供新的免疫治疗途径。 ICOS(Inducible 共刺激信号在机体的免疫反应调节中发挥重要的生物学效应，它能促进T细胞活化增殖以及细胞因子的分 泌，参与诱导Th细胞的极化【3~51。 法获得转基因小鼠，并检测证明外源基因整合并稳定传代，同时对其生物学特性进行初步研究。 1材料与方法 1．1主要试剂 Ecoli I、StuI、NheI、BamH ToplO购自Invitrogen公司；质粒pEGFP．N3购自Clontech公司。Ase l、T4 和基因组提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；胶回收试剂盒为QIAGEN公司产品。 剂盒购自上海华舜公司。孕马血清促性腺激素PMSG和人绒毛膜促性腺激素HCG购自宁波激素厂。 1．2主要仪器 PCR仪购自Biometra公司，二氧化碳培养箱购自贺利氏公司，体视显微镜购自厦门麦克奥迪公司， 显微注射仪购自新飞达光学仪器公司。 1．3动物 清洁级FVB和CD．1小鼠由苏州大学动物实验中心提供。所有实验用小鼠均饲养于清洁级环境，温度 Ix。 为(22±3)℃，相对湿度为40％～70％，换气次数为15次／h，照明周期为12h明／12h暗，照度为165—280 饲料为苏州双狮公司60Co辐照饲料，水和饲料自由饮食。 326 华东地区第十届实验动物科学学术交流会 1．4人扁桃体淋巴细胞制备及活化 扁桃体手术切除标本(取自苏州大学附属第一人民医院耳鼻喉科)，剪碎研磨后获得细胞悬液，经 Fieoll梯度离心分离淋巴细胞，PBS洗涤，调整细胞浓度为5×10Vml，加PHAf10 lag／m1)，在37℃、 5％C02下，于RPMIl640培养基中培养4d，收集细胞，提取RNA备用。 根据人ICOS全长cDNA序列设计并合成相应引物，上游5-GTTGCTAGC min；然后94℃， 链，然后加ICOS上下游引物、dNTP和Taq酶，反应体系为100雎1，94℃，变性5 45 S；58℃，45 S；72℃，lrain；循环33次，72℃延伸5min。1．2％琼脂糖凝胶电泳检测，切取 约600