蛹虫草无性单孢菌株分离及其配对选育.docVIP

蛹虫草无性单孢菌株分离及其配对选育 　　摘要 分别以菌株JW14-1和CW15为材料，分离出只具有交配型Ⅰ基因的无性单孢子和只具有交配型Ⅱ基因的无性单孢子，将这2种无性单胞菌株进行配对，通过测定虫草素含量对配对后的变异株进行选育，获得2株虫草素含量显著增加的优良变异菌株；进一步利用RT-PCR技术检测虫草素合成相关基因的表达情况。结果表明：虫草素含量高的菌株6号配对株中腺苷酸琥珀酸合成酶基因的表达水平最低，而5′-nucleotidase基因和嘌呤核苷磷酸化酶基因的表达水平则最高。该研究为蛹虫草的定向选育提供了新的思路 关键词 蛹虫草；无性单孢子；虫草素；配对选育 中图分类号 S567.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）23-0091-02 Abstract Theasexual single spore strains with mating type Ⅰ gene or mating type Ⅱ gene were isolated from strain JW14-1 and CW15，respectively，and the two mutant strains with higher cordycepin content were selected through the matching selection with these two asexual single spore strains.Further researches indicated the No.6 strain with high content of cordycepin showed the low expression level of adenylosuccinate synthetase and high transcriptional level of 5′-nucleotidase and purine nucleoside phosphorylase.This study provided a novel idea for the directional breeding of Cordyceps militaris. Key words Cordyceps militaris；aesual single spore；cordycepin；matching selection 蛹虫草（Cordyceps militaris），又称北虫草，属子囊菌亚门（Asicomyxotinae）麦角菌科（Clavicipitanceae）虫草属[1]。它是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目、鞘翅目、双翅目等夜蛾科昆虫蛹体及幼虫上形成的虫菌复合体[2]。蛹虫草是一种具有滋补作用的中药和营养品，其主要包含虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、麦角甾醇等物质，功效与冬虫夏草相似，而且虫草素含量和抗氧化活性高于多重夏草，是冬虫夏草良好的代用品[3-4]。虫草素作为蛹虫草重要的生物活性成分之一，自从20世纪中期被发现并分离得到纯品开始，人们就不断研究虫草素的生物活性作用，包括抗肿瘤、免疫调节、抑制抗炎、与环磷酰胺有明显的协同作用，并有降血糖的作用[5] 自然界原始分离得到的蛹虫草菌株中虫草素含量一般较低，因此选育虫草素含量高、生长迅速的蛹虫草新菌种有着十分重要的意义。现阶段一般主要采用化学诱变、辐射诱变、航天诱变、有性单孢杂交等方法选育蛹虫草新菌种，笔者采用无性单孢子配对的方法选育蛹虫草新菌种，为蛹虫草的定性选育提供新的思路与技术支撑 1 材料与方法 1.1 试验材料 本研究所用的菌株JW14-1采购于中国典型培养物保藏中心，菌株CW15采自于长白山。尖草型菌株JW14-1分离出的单分生孢子挑选出只具有交配型I基因的单孢菌株，野生菌株CW15分离出的单分生孢子挑选出只具有交配型II基因的单孢菌株 1.2 试验方法 1.2.1 蛹虫草无性单孢子分离株的获得与配对。将供试菌种接种于PDA平板上，25 ℃避光培养7 d后进行转色，在超净工作台中，取1 mL无菌水洗脱菌丝体，经过4层无菌纱布后过滤收集孢子悬液。在显微镜下观察收集的孢子悬液，根据观察结果对孢子悬液进行适当稀释。取0.1 mL稀释后的孢子悬液在含有PDA培养基的培养皿中进行均匀涂布，然后将涂布培养的培养皿于20 ℃避光倒置培养7 d待有肉眼可见的菌落出现后，挑取单菌落，将单菌落中的菌丝体接入新的PDA平板上25 ℃避光培养，菌丝体长满平板后，刮取菌丝。将经过检测的含有不同交配型基因的单孢菌丝放入同一瓶种子培养液中，22 ℃，避光震荡培养（125 r/min）4 d后开始出草试验工作 1.2.2 基因组DNA的提取。采用改进的