HPLC法测定不同外植体诱导虎杖愈伤组织中大黄素含量论文.docVIP

　　HPLC法测定不同外植体诱导虎杖愈伤组织中大黄素含量论文 .freelg/L＋KT 0.2 mg/L＋2,4-D 0.5 mg/L为培养基,分别以虎杖的叶片、茎段、叶柄为外植体,诱导出愈伤组织；采用Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：27 ℃；进样量：20 μL。结果 由叶片、茎段、叶柄所诱导的愈伤组织中大黄素含量分别为0.709 6、1.680 0、0.166 8 mg/g,大黄素在0.25～5 μg/mL浓度范围内线性关系良好,r=0.999 85,平均加样回收率为101.19%,RSD＝1.20%。结论 HPLC法可用于愈伤组织中大黄素的含量测定,且由茎段所诱导的愈伤组织中大黄素含量较高。 【关键词】 虎杖 外植体 愈伤组织 大黄素 高效液相色谱法 Abstract：Objective To investigate the effect of different explants on emodin contents in the callus of Polygouum cuspidatum by reverse-phase HPLC. Methods The leafs, stems and leaf stalks of Polygouum cuspidatum edium containing 6-BA 0.2 mg/L, KT 0.2 mg/Land 2,4-D 0.5 mg/L. The contents of emodin ed on Diamonsil-C18 (250 mm×4.6 mm,.freel) column, using methanol-0.1% H3PO4 (80∶20) as mobile phase, detected at 254 nm. The floL/min, the column temperature odin g/g in the callus induced by leafs, stems and leaf stalks. The linear range of emodin L, r＝0.999 85, the average recovery ethod could be used for the contents determination of emodin in Polygouum cuspidatum callus and the contents of emodin s. Key cuspidatum；explant；callus；emodin；HPLC 目前药用植物细胞培养技术发展迅速,已从被研究的400多种植物细胞中分离出600多种次生代谢产物,其中有60多种在含量上超过或等于原植物1,因此,利用细胞工程技术生产有用的次生代谢物质具有广阔的前景。虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)是蓼科蓼属多年生灌木状草本植物虎杖的干燥根茎和根,性苦寒,归肝、肺、胆经,具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀之效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、关节痹痛、经闭经痛2。其根茎富含大黄素、虎杖苷、白藜芦醇等多种活性成分。药理学研究表明,其主要活性成分大黄素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、平喘等多种功效3。本实验通过对虎杖叶片、茎段、叶柄3种不同外植体诱导出愈伤组织,并采用HPLC法测定愈伤组织中大黄素的含量,研究不同外植体对愈伤组织中大黄素含量的影响,从而为利用细胞工程方法生产大黄素提供一定的实验依据。 1 仪器与材料 Agilent 1100 series 高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Agilent色谱化学工作站。 大黄素对照品(中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用,批号756-9203)；虎杖愈伤组织为安徽省中药研究与开发重点实验室自行培养。甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 愈伤组织培养4 选取健壮无病的虎杖植株,取其叶片、茎段、叶柄,用自来水冲洗干净。晾干后,在超净工作台内用75%酒精消毒30 s,无菌水冲洗1次,然后用0.1% HgCl2溶液消毒8 min,再用无菌水冲洗5次,每次5 min,置无菌滤纸上晾干,切成0.5 cm×0.5 cm的小块,接种在MS＋6-BA 0.2 mg/L＋KT 0.2 mg/L＋2,4-D 0.5 mg/L培养基中,温度(25±1)℃培养,30 d后收获愈伤组织,60 ℃下烘干备用。 2.2 色谱条件的选择及