Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析论文.docVIP

　　Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析论文 【摘要】 目的 克隆Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因。方法 在已经克隆得到的Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶cDNA片段的基础上，首先通过PCR扩增得到与其相对应的基因组DNA片段，然后分别通过Mini基因组DNA文库法和Panhandle PCR法扩增其上游和下游未知片段，最后通过PCR法扩增得到类枯草菌素蛋白酶基因片段。结果 克隆得到1 519bp Pr1蛋白酶基因序列YP1977，DNAassist软件分析其中含有一个969bp的完整的开放阅读框，编码323个氨基酸，NCBI BlastX比对结果显示，该阅读框可能编码的氨基酸序列与多个物种的Pr1蛋白酶都具有较高的同源性。结论 YP1977很可能是Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的部分片段.freel Pythium sp.GY1938 Abstract：Objective To obtain the full-length genomic DNA sequence of the subtilisin-like protease(Pr1)gene from Pythium sp. GY1938.Methods Basing on the obtained cDNA sequence of the Pr1 from Pythium sp.GY1938,a genomic DNA fragment corresponding to the cDNA plified by PCR firstly.Then the upstream and do unknoents ini genomic DNA library and panhandle PCR methods.In the end,the gene fragment of the Pr1 plified by PCR.Results A 1 519bp DNA fragment called YP1977,in ino acids analysed by DNAassist soft Pythium sp.GY1938 ent,YP1977,is the Pr1 gene from Pythium sp.GY1938 in all probability.Houst be validated further by the construction of expression system. Key ic DNA library；panhandle PCR 蚊虫是世界性害虫，能够通过叮咬、吸血在人际间传播多种烈性传染性疾病，如疟疾、登革热等，给人类的日常生活和健康带来严重的负面影响［1］。但是，由于菊酯等化学杀蚊剂的长期滥用，使得3R(再猖獗Resurgence、抗药性resistance和残毒residue)问题日益严重［2-3］。近年来，随着对有害昆虫进行生物综合防治的科学观念的推广，一种在自然界中能主动致病蚊虫、控制蚊虫群体的病原真菌——Pythium sp.GY1938菌株作为蚊虫生物防治的新生力量正逐渐引起人们的重视和应用［4］。Pythium sp.GY1938菌株是由贵阳医学院苏晓庆教授等分离得到的一株具有自主知识产权的高效特异杀灭蚊幼虫——孑孓的水生丝状真菌，可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径，在蚊虫防治和保护人类身心健康中起着十分重要的作用［5］。通过研究发现，与其它昆虫病原真菌一样，Pythium sp.GY1938菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶、几丁质酶和脂酶等水解酶［6］。这些水解酶和机械压力共同作用，促进菌丝刺穿孑孓坚硬的体壁，是孑孓的主要致病因素之一［7］。因此，克隆Pythium sp.GY1938菌株侵染孑孓体壁的重要致病基因将会为研究其致病机制，通过基因工程技术改造菌株、提高菌株毒力奠定基础。 1 材料和方法 1.1 菌株 Pythium sp.GY1938菌株由贵阳医学院生物防治课题组分离保存。 1.2 基因组DNA的提取成都医学院学报 J．C D M C 2006.1.1 杨 平，等.Pythium sp.GY1938菌株类枯草菌素蛋白酶Pr1基因的克隆与序列分析 成都医学院学报 JOURNAL OF CHENGDU MEDICAL COLLEGE 2006年第1卷第1期 采用氯化苄法提取基因组DNA，具体步骤参照文献［8］。 1.3 Pr1基因GYPR1-1片段的克隆 根据MOPAC法已经克隆得到的cDNA片段设计引物，以Pythium sp.GY1938菌株基因组DNA为模板进行