RAPD在绞股蓝种类鉴别应用上的条件摸索论文.docVIP

　　RAPD在绞股蓝种类鉴别应用上的条件摸索论文 罗育，李雄英，吴耀生，蒋军富，赵瑞强，曾麒燕 【摘要】 目的为采用随机扩增多态性技术鉴别绞股蓝及其易混品乌蔹莓，进行RAPD条件摸索。方法运用改进CTAB法提取七叶绞股蓝、五叶绞股蓝、乌蔹莓以及烟草基因组DNA，摸索影响RAPD的条件。结果用改进CTAB法提取所得的DNA质量较好.freelma pentaphyllum from the mixed plant, Cayratia japonica proved CTAB method e DNA from Jiao Gu Lan(Gynostemma pentaphyllum) Seven Leaves Jiao Gu Lan, Cayratia japonica and Tobacco, respectively. The optimum conditions of RAPD proved CTAB method, the extracted DNA presented better quality and could be used to progress RAPD. The optimum conditions for RAPD have been successfully explored. Conclusion The improved CTAB method is suitable to extract genome DNA from the four medicinal plants, respectively, and the conditions explored ma Pentaphyllum and distinguish it from the mixed plant, Cayratia japonica. Key ma pentaphyllum; Genome DNA; RAPD; Identification 绞股蓝Gynostemma pentaphyllum，(Thunb) Makino系葫芦科绞股蓝属多年生攀缘草质藤本植物。绞股蓝具有较广泛的生态适应性，自然分布于秦岭及长江以南的15个省区。绞股蓝全草入药，有清热解毒、镇咳祛痰、抗癌、降血脂、防衰老、抗疲劳等功能，临床上应用于老年慢性支气管炎、哮喘、胃肠炎和传染性肝炎等疾病的治疗。从绞股蓝属植物中分离出的84种皂苷中有6种与人参皂苷的四环三萜达玛烷型结构完全相同，所以有“南方人参”的美誉。 RAPD（random amplified polymorphic DNA）技术是1990年由akino和乌蔹莓Cayratia japonica (Thunb) Gagn由广西药用植物园凌征柱教授提供；烟草（Tobacco）由中国科学院上海植物生理生态研究所提供。因绞股蓝掌状叶片常有五枚小叶，本文中称为五叶绞股蓝；另外，采集了另一种掌状叶片均为七枚小叶的绞股蓝，本文中称为七叶绞股蓝，其种类待鉴定。 1.2 仪器 电泳仪（DYY-10C型，北京六一仪器厂）；SmartspecTMplus核酸蛋白测定仪（Bio-RAD Lab，Inc，USA.）；MyCyclerTM PCR仪(Bio-RAD Lab, Inc，USA.)；UVI-7600Z凝胶成像系统。 1.3 试剂 CTAB，BSA（牛血清白蛋白），琼脂糖，10碱基引物均购自上海生工生物工程有限公司；Taq酶，dNTP，MgCl2均购自宝生物工程（大连）有限公司。 2 方法 2.1 基因组DNA的提取 采用CTAB法，参照陈莉等［5］方法加以改进。具体操作：①新鲜叶片液氮中过夜，加液氮进行研磨至细粉末状后，迅速转入离心管中；加65℃预热1.5×CTAB提取缓冲液［1.5%CTAB，75 mmol/L Tris-HC1 (pH8.0)，15 mmol/L EDTA (pH8.0)，1.05 mol/L NaCl］混匀，65℃水浴20 min；取出冷却至室温，6 200 r/min离心10 min。②收集上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，6 200 r/min离心10min。再收集上清液，加1/10体积1×CTAB提取缓冲液（1% CTAB，0.7 mol/L NaCl）及等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，6 200 r/min离心10 min；重复1次。③上清液加入等体积1×CTAB沉淀缓冲液［1.0%CTAB，50 mmol/L Tris-HC1(pH8.0)，10 mmol/L EDTA(pH8.0)］混匀，65℃水浴30 min。冷却至室温，6 200 r/min离心10 min。弃上清液，加0.5 ml 1 mol/L NaCl，沉淀完全溶解后加2.5倍体积预