SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达论文.docVIP

　　SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达论文 【关键词】 肝肿瘤 Stable inhibition of hTERT gene by siRNA in hepatocarcinoma cells 【Abstract】 AIM: To elucidate the timeefficiency relation of stable inhibition of hepatocarcinoma cell proliferation by RNA interference in vitro. METHODS: The stable screeninginhibition technique of RNAi all hairpin RNA (shRNA) targeting hTERT gene a SMMC7721 cells, a cell lines stablely expressing pGenesilshRNAhTERT. Realtime RTPCR, MTT and PCRTRAP RNA expressions, telomerase activity and cell proliferation. RESULTS: The effectiveness of RNAi existed continually and stably in hepatocarcinoma SMMC7721 cells expressing stably pGenesilshRNAhTERT. In the cell lines expressing stably pGenesilshRNAhTERT, hTERT mRNA erase activities a SMMC7721 cell proliferation significantly inhibited in pGenesilshRNAhTERT group pared to that in negative control group. CONCLUSION: RNAi may continually and stably suppress hTERT mRNA expression and carcinoma cell proliferation, or gene therapy. 【Keys; telomerase 【摘要】 目的： 利用RNA干扰稳定筛选抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时效关系. 方法： 设计靶向hTERT基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesilshRNAhTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNAhTERT的细胞株. 采用realtime RTPCR、MTT和PCRTRAP法同时检测pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组和未处理SMMC7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化. 结果： 在稳定表达pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERT mRNA表达、端粒酶活性明显降低.freelRNA表达及肿瘤细胞增殖，是有潜力的基因治疗肿瘤新方法. 【关键词】 RNA干扰；肝肿瘤；端粒，末端转移酶 0引言 端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关［1］， hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5%［2］. 研究表明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋亡，导致细胞永生化［3］. 我们依据RNA干扰（RNA interference, RNAi）原理，使用短发夹样RNA（small hairpin RNA, shRNA）设计的RNAiDNA载体方法［4］，以hTERT基因为靶点，构建稳定表达小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA) 的肝癌SMMC7721细胞株，从体外研究siRNA稳定、特异诱导hTERT基因转录后沉默，逆转癌细胞恶性表型的能力，探讨RNAi基因治疗恶性肿瘤的时效性. 1材料和方法 1.1材料 肝癌SMMC7721细胞株购自上海细胞生物研究所. 质粒pGenesil1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司. 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自Roche公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000等分别购自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHyb Kit购自华美生物工程公司. Taqman探针和引物由Takara公司合成，hTERT及内参PO的探针和引物序列参照文献［4］. siRNAhTERT转录模板由上海博亚公司合成.