siRNA靶向Her2逆转录病毒载体构建及其在SKOV3中的表达论文.docVIP

　　siRNA靶向Her2逆转录病毒载体构建及其在SKOV3中的表达论文 周颖，凌斌，高婷，陈敏，冯定庆，程志祥，朱园园，赵卫东.freel into retroviral vector RNAiReady pSIRENRetroQ. Subsequently the plasmids ycin later. SKOV3 ycin, many of RNA and p185 by RTPCR and immumohistochemistry methods, pared to ent of stable SKOV3 cell lines alignant biological activity of tumor cell lines by transfection of siRNA retroviral vector specific for Her2. Key H I、 EcoR I、 T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；大肠杆菌菌株E.coli DH5α购自上海生工生物工程有限公司；脂质体Lipofect2000、总RNA 提取试剂Trizol购自Invitrogen公司；小剂量质粒提取试剂盒、逆转录试剂盒购自Promega公司；DEPC购自Sigma 公司； TaqDNA聚合酶购自华美生物工程有限公司；上、下游引物由上海生物工程有限公司合成。Her2抗体(鼠抗人单抗)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SP9102 试剂盒为Zymed 公司产品。 1.1.2 细胞株 SKOV3细胞株购自上海细胞所；包装病毒细胞株PT67购自BD公司；细胞培养基DMEM、McCoy’s 5A Medium Modified、新生小牛血清、特级胎牛血清均购自GIBCOL公司。培养液均含有100mg/L的氨苄青霉素和链霉素，37℃、5%CO2饱和湿度下培养。嘌呤霉素购自Invitrogen公司，经生理盐水配成2.5mg/ml，－20℃保存备用。氯喹购自Sigma 公司，经生理盐水配成25mM， 4℃保存备用。聚凝胺(polybrene) 购自Sigma 公司，经生理盐水配成4mg/ml，4℃保存备用。 1.2 方法 1.2.1 目的基因的设计及合成 根据GenBank提供的Her2基因cDNA序列, 通过基因Blast, 挑选长为19bp与21bp的2段Her2特异性寡核苷酸，其序列分别为5′GGACATCTTCCACAAGAAC3′，5′GCTCTTTGAGGACAACTATGC3′, 对照序列为5′GTGCGTTGCTAGTACCAAC3′。合成其发卡样两端配对寡核苷酸链, 用含9个碱基的圈连接起来，分别在5′和3′端引入BamHI与 EcoRI 酶切位点，并在转录终止信号后引入MIuI特殊酶切位点以检验所构建重组载体是否正确。 1.2.2 逆转录病毒载体的构建 将合成的上下链经过变性、复性后形成双链Her2基因siRNA，采用双链定向亚克隆入逆转录病毒载体RNAiReady pSIRENRetroQ，氯化钙转化方法 2转化大肠杆菌菌株E.coli DH5α,.freelg/L）筛选出阳性克隆，提取质粒，见表1。表1 Her2特异性发卡样寡核苷酸序列（略） 1.2.3 重组质粒Her2/siRNA的鉴定 用MIu I将重组质粒进行限制性内切酶消化,酶切产物行0.5%琼脂糖凝胶电泳。阳性克隆分别命名为Her2/siRNA1、Her2/siRNA2、Her2/siRNA negtive control，纯化后送到上海生工生物工程有限公司测序鉴定。 1.2.4 重组质粒转染包装病毒细胞株 将包装病毒细胞PT67种到6孔板中，每孔1×105，完全培养基培养12h后用RPMI 1640洗涤2次，更换含25μM氯喹的DMEM培养1h，分别将Her2/siRNA1、Her2/siRNA2、Her2/siRNA negtive control各5μg转染PT67，脂质体Lipofect2000 5μl／孔。转染4h后，更换完全培养基，24h后加入1.875μg/ml嘌呤霉素筛选2～3周。 1.2.5 重组逆转录病毒感染SKOV3 产病毒细胞株PT67达90%汇合后换成无嘌呤霉素的完全培养基，24h后收集细胞上清，经0.45μm滤膜过滤，滤液-70℃保存或立即进行感染。SKOV3培养至对数生长期，弃去原液，加入1ml产病毒细胞株PT67的细胞上清滤液和1.33μg/ml的聚凝胺，37℃、5%CO2条件下培养1h, 重复感染1次, 继续培养24h，更换含1.875μg/ml嘌呤霉素的完全培养基筛选培养,每3～4d换液,约20d后筛选成活的细胞扩增至完全汇合, 以后