一种新的重组腺病毒载体pAdBM5GFPmAFP的构建论文.docVIP

　　一种新的重组腺病毒载体pAdBM5GFPmAFP的构建论文 匡志鹏，谢裕安，梁安民，罗小玲，吴继宁 【摘要】 目的 构建表达小鼠甲胎蛋白（murine alpha fetoprotein，mAFP）基因的重组腺病毒载体pAdBM5GFPmAFP，并测定其滴度。方法 从Hepa16小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物.freelAFP基因，测序确认后,插入到pAdBM5GFP穿梭载体中，双酶切鉴定重组腺病毒载体。线性化重组腺病毒载体与病毒骨架DNA质粒用磷酸钙共沉淀法共转染HEK293A细胞，通过同源重组使腺病毒表达mAFP基因，并在HEK293A细胞中大量扩增含目的基因的重组腺病毒，用TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果 成功克隆了小鼠mAFP基因，构建出表达mAFP基因的重组腺病毒载体pAdBM5GFPmAFP，获得了表达mAFP基因的重组腺病毒，病毒滴度达3.2×108PFU／ml。结论 本研究成功构建了pAdBM5GFPmAFP载体，获得了高滴度表达mAFP基因的重组腺病毒，为进一步开展肝癌的免疫基因治疗奠定了基础。 【关键词】 pAdBM5GFP；小鼠甲胎蛋白；重组腺病毒载体 Abstract：Objective To construct a novel rebinant adenovirus vector pAdBM5GFPmAFP and detect virus titer. Methods Total RNA hepa16 murine liver cancer cell line, mAFP(murine alpha fetoprotein，mAFP) gene ethod. The gene e I restrict enzyme digestion to construct pAdBM5GFPmAFP rebinant vector. mAFP gene ologous rebinant in HEK293A cells after pAdBM5GFPmAFP vector and virus skeleton plasmid cotransfected HEK293A cells by standard calcium phosphate coprecipitation method. Virus titer ethod. Results pAdBM5GFPmAFP rebinant vector AFP gene l. Conclusion pAdBM5GFPmAFP rebinant adenoviral vector carrying mAFP gene ary liver cancer. Key AFP；Rebinant adenovirus vector 0 引言 大多数肝癌细胞过表达AFP抗原。Meng等［1,2］认为人甲胎蛋白是最重要的一种肝癌治疗性靶抗原。Vollmer 等［3,4］也发现尽管小鼠的免疫系统长期暴露于AFP环境中，当被合适地或特异性地激发时，仍能对这种胚胎性抗原产生较强的T细胞免疫反应。由此说明，AFP能够作为一种潜在的诱导特异性CTL反应的肿瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性免疫治疗。因此，本研究将肝癌相对较为特异的甲胎蛋白（AFP）基因构建到含有强力启动子的pAdBM5腺病毒载体中，从而扩增出大量高效表达目的基因的重组腺病毒，为开展肝癌的靶向性免疫基因治疗完成关键的一步。 1 材料与方法 1.1 腺病毒和细胞株 Hepal6细胞为C57BL/6小鼠来源的肝癌细胞株，可分泌小鼠甲胎蛋白（mAFP），由第二军医大学王皓博士惠赠。HEK293A细胞、pAdBM5GFP穿梭载体和腺病毒转染试剂盒购自Qbiogene公司。TOP 10感受态细胞购自北京天为时代科技有限公司。 1.2 主要试剂 DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(GIBCO)，Trizol(Invitrogen)，MMLV逆转录酶、pGMT Easy载体和T Ligase（Promega），PyrobestTM DNA聚合酶（TaKaRa），Bgl II和Pme I内切酶（BioLabs）。 低熔点琼脂糖SeaplaqueR购自毕特博生物技术公司。质粒提取试剂盒，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自上海华舜生物科技公司。 1.3 方法 1.3.1 Hepal6细胞的培养及总RNA的抽提 采用DMEM培养液及10% FBS常规培养Hepal6细胞，每3天换液传代。取约106个细胞抽提总RNA，操作按Trizol试剂说明进行。 1.3.2 RTPCR 扩增mAFP基因 上游引物：5′AAGATCTCTGCG