丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究论文.docVIP

　　丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究论文 徐秀梅，郭茂娟 赵旭 范英昌 【摘要】 目的 观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs，对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L)，诱导24 h后继续培养4周，观察其形态学变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T (cTnT)的表达, 实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT.freel, FBS）,Hyclone公司；D-Hanks缓冲液； percoll淋巴细胞分离液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗体〔Rabbit Anti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体（Rabbit Anti-CD34）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体Troponin T, Cardiac Isoform Ab-3(Clone CT-3)，美国Lab vision公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒(cat.no.MSP859143)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents、SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒(Applied Biosystems)、Trizol总RNA提取试剂，天津润泰科技发展有限公司；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；SSCs的分离培养 将大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hanks液冲洗骨髓，100目筛网过滤，将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min,20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞,用L-DMEM离心洗涤2次（800 r/min,5 min）后接种于完全培养液（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的L-DMEM培养液），置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，24 h后首次换液，以后每3 d更换1次培养液，2周后细胞长满瓶底。 2.2 MSCs的传代及纯化 待原代MSCs长满瓶底时，用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA对细胞进行消化2～3 min，以完全培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液,.freelin，PBS彻底清洗。滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗。滴加以1∶100浓度稀释的一抗（兔IgG）4℃过夜。余按SABC免疫组化试剂盒操作说明进行。苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。 2.4 MSCs的诱导分化 将第9代MSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板中，培养2 d，将完全培养液换为无血清培养液，24h后进行分组诱导：SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-aza组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L，10 μmol/L)，并设空白对照组,仅用基本培养液(L-DMEM)诱导。诱导剂作用24 h后，更换完全培养液继续培养，每3 d换液1次，共4周。 2.5 免疫细胞化学鉴定心肌特异性蛋白cTnT 取诱导后4周的细胞，用95％乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS彻底清洗。用羊血清封闭，滴加cTnT(1∶50)，阴性对照用PBS代替一抗cTnT，4℃冰箱过夜。其余步骤按超敏S-P试剂盒操作程序进行，最后苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树脂封固。显微镜下观察，胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。每组选取染色较好的8张玻片，在显微镜下每张玻片取5个视野，由数码摄像机摄入，用Image Pro Plus6.0图像分析软件对结果进行分析。 2.6 实时荧光定量RT-PCR检测 心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达 取诱导后4周的细胞，按以下步骤进行操作：(1)RNA提取与cDNA的合成:取诱导后4周的细胞，采用Trizol一步法提取总RNA，按照试剂盒说明进行反转录，反转录条件为：25℃10，48℃3