人MUC1与GM论文.docVIP

　　人MUC1与GM论文 .freelid containing human MUC1 gene and GMCSF gene Abstract AIM: To construct an eukaryotic coexpression plasmid containing the coding region of human MUC1 tandem repeats gene and GMCSF gene and to identify its expression in COS7 cell. METHODS: MUC1 tandem repeats gene ents. After identified by restriction endonuclease digestion analysis and DNA sequencing, MUC1 tandem repeats gene and GMCSF gene id pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF. Then the rebinant plasmid munoflourescence and ELISA. RESULTS: Restriction analysis and DNA sequencing shoid contained the coding region of human MUC1 tandem repeats gene and GMCSF gene. The expression of MUC1 and GMCSF id pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF lay a foundation for further development of DNA vaccine against breast cancer. Keyorphic epithelial mucin, PEM), 是乳腺癌等多种肿瘤的分子标志物。MUC1基因的一个重要特征是其多态性(polymorphism)［1］, 即第2个外显子中含有许多连续重复序列(variable number of tandem repeat, VNTR), 抗原表位即位于VNTR区。此种肽链表位在正常表达时, 被MUC1外周糖链所掩盖, 不能被识别。在癌变细胞表面, 由于糖基化不全抗原表位才得以暴露, 成为肿瘤主动特异性免疫治疗的理想靶分子。在以前的实验中, 我们发现MUC1基因疫苗可诱导小鼠产生特异性CTL及体液免疫应答, 抑制小鼠乳腺癌细胞的生长［2］。巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）是目前研究最多的细胞因子之一, 其主要通过增强树突状细胞（DC）对抗原的加工和提呈而成为一种有效的免疫调节剂［3］。但GMCSF基因与MUC1基因嵌合重组后有无增强MUC1基因疫苗对乳腺癌细胞生长的特异性抑制作用, 国内外尚未见报道。本研究中, 我们成功地构建了人MUC1 VNTR串联体基因与GMCSF基因嵌合体的真核表达载体pcDNA3.1(+)MUC1GMCSF, 并在COS7细胞中稳定表达, 为乳腺癌的免疫治疗研究奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 真核表达载体pcDNA3.1(+)由英国Imperial Cancer Research Fund的TaylorPapadimitriou教授惠赠。pGEM3zf()GMCSF质粒、 COS7细胞、 pUC18载体及E.coli DH5α均由本室保存。BALB/c小鼠, 4～6 周龄, 质量15～20 g, 由本校实验动物中心提供。E.Z.N.AR plasmid Miniprep Kit 购自Omega公司; 核酸的凝胶纯化试剂盒NucleoTrapR Gel Extraction Kit购自 Clontech 公司。抗MUC1单克隆抗体（mAb）为Antibody Diagnostica 公司产品。羊抗鼠IgG FITC购自华美公司。限制性内切酶、 T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。化学试剂均为国产分析纯。小牛血清购自杭州四季清生物工程材料研究所。DMEM培养基购自GIBCO公司。RPMI1640培养液为Sigma公司产品。人GMCSF的ELISA检测试剂盒购自Clontech公司。 1.2 方法 1.2.1 MUC1重复序列串联体基因的克隆 按MUC1基因重复序列合成含带信号肽的MUC1基因单体片段, ①合成片段F1的序列为: 5′AGCTT TTC TTC CTG CTG CTG CTC CTC ACA GTG CTT ACA GTT GTT GGA TCC GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT GTC ACC TCG GCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC CCG AGA T