人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定论文.docVIP

　　人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定论文 .freelin，10min，12min。倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长.freelin获得的细胞数量多，成活率高。 【关键词】 人脐静脉 内皮细胞 细胞培养 分离 改进 Improvement of separation ，culture and identification of human 【Abstract】 Objective To investigate the primary culture method of ehdothelial cells from human umbilical vein and improve the rate of successful culture in vitro.Methods 0.125%，0.25% trpsin and 0.1% collagenase an umbilical vein by using disposable vein transfusion needle No.5，after orphology and immunohistochemistry under inverted microscope.Results The cultured cells had a cobble stone appearance onolayer groany endothelial cells after digested by 0.125%，0.25% trpsin and 0.1% collagenase for 15 minutes，10 minutes，12 minutes respectively.Conclusion The collagenase human umbilical vein. 【Key an umbilical vein endothelial cells cell culture separation improvement 血管内皮细胞具有多种生理功能，能产生和分泌许多生物活性物质，在维持血管舒缩，抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。本文报告利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌流消化法［1］分离脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）成功传代培养并予鉴定，方法可靠，简便易行，有利于后续实验研究的进行。 1 材料与方法 1.1 标本采集 在无菌条件下取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带（长于20cm）后，去除脐带血管中的残余血液，放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中，6h内行脐静脉内皮细胞分离、培养。 1.2 试剂 RPMI1640培养基（美国GIBCO公司），新生小牛血清（杭州四季青生物公司），Ⅰ型胶原酶（美国GIBCO公司），胰蛋白酶(美国GIBCO公司)，兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。 1.3 仪器 Ⅱ级生物安全柜（苏净集团安泰公司），CO2培养箱(日本SANYO)，倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。 1.4 试剂配制 RPMI1640完全培养液：20%新生小牛血清，80%RPMI1640，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。Ⅰ型胶原酶溶液：用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液配制，0.22μm滤膜滤过除菌，保存于-20℃。 1.5 人脐静脉内皮细胞原代培养 无菌条件下取新生儿脐带，在Ⅱ级生物安全柜内剪去钳痕、血肿、凝血块阻塞部分，分成20cm一段，采用5号带柄一次性静脉输液针吸取36℃预热双抗PBS，插入脐静脉断端，同时结扎固定针体，反复将静脉内残血冲洗干净，再用血管钳夹闭脐带另一端，然后分别注入所配制0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化液，使管腔充盈，37℃，作用6、8、10、12、15、17min；松开一端血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%新生小牛血清的RPMI 1640培养液再次冲洗管腔，以获得更多的内皮细胞；将消化液和冲洗液一并注入离心管，800r/min，离心5min，弃上清，加入RPMI 1640培养液，吹打均匀，制成细胞悬液，按2×105个细胞/瓶接种于25cm2一次性培养瓶中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液去除未贴壁细胞，然后每隔24h半定量换液一次至细胞生长融合。 1.6 人脐静脉内皮细胞传代培养 待细胞生长成单层细胞后，弃去培养瓶中的培养液，然后加入0.125%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液约2ml，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后吸弃消化液，用Hanks液洗一