分子克隆操作技术注意事项.doc

分子克隆操作技术注意事项 引物设计 设计模板：基因过表达的设计模板为mRNA（根据基因名称和样品种属从NCBI查询）, 启动子（转录调控区域）的设计模板为基因组DNA片段（根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列），DNA甲基化分析（CpG岛，根据基因名称和种属从UCSC查询，并在NCBI核实序列）； 设计软件：Vector NTI用于设计过表达引物，Vector NTI用于设计启动子（转录调控区域）克隆引物；Methprimer用于设计DNA甲基化分析引物（BSP, MSP） 5’和3’端的酶切位点和保护性碱基 所用的载体的多克隆位点（MCS）有，所克隆的序列没有，可以同时做双酶切，我们的酶库有，价格便宜的，加了保护性碱基可以直接进行PCR产物酶切的（详情见《保护性碱基.doc》）； 引物溶解 引物的储液浓度为100μM, 计算加入灭菌水的量； 打开管盖前，必须先12000RPM离心2min,因为引物为粉末，容易飘出; 加入灭菌水溶解前，应稍微打开管盖即可，以免粉末飘出； 引物溶液应-20℃保存； 引物使用的工作液浓度为10μM, 需要多少稀释多少，剩余的应丢弃； PCR 操作注意事项：操作前，应熟知所用PCR酶的说明书，并熟知说明书标示的注意事项（引物、模板和酶的建议用量，变性温度及时间，延伸速度等），PCR是极为灵敏的技术，因此要决定避免交叉污染，注意冰上操作，